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藥品質(zhì)量檢測(cè)方法：熒光分光光度法
2022年08月24日 10:35:53
來源：化工儀器網(wǎng) 點(diǎn)擊量：6737
熒光分光光度法是根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的方法。
【化工儀器網(wǎng) 行業(yè)百態(tài)】熒光是指物質(zhì)分子在激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)返回到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)時(shí)所發(fā)出來的光，比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)。熒光分光光度法是根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的方法。當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度、波長(zhǎng)、所用溶劑和溫度等條件固定時(shí)，物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)，其發(fā)射光強(qiáng)度與溶液中該物質(zhì)的濃度成正比關(guān)系，可以用于該物質(zhì)的含量測(cè)定。
由于不同的物質(zhì)其組成與結(jié)構(gòu)不同，所吸收的紫外-可見光波長(zhǎng)和發(fā)射光的波長(zhǎng)也不同，同一種物質(zhì)應(yīng)具有相同的激發(fā)光譜和熒光光譜，將未知物的激發(fā)光譜和熒光光譜圖的形狀、位置與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的光譜圖進(jìn)行比較，即可對(duì)其進(jìn)行定性分析。如果該物質(zhì)的濃度不同，它所發(fā)射的熒光強(qiáng)度就不同，測(cè)量物質(zhì)的熒光強(qiáng)度可對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定。
熒光分光光度法的特點(diǎn)是靈敏度高、選擇性好、樣品用量少和操作簡(jiǎn)便，常用于微量甚至痕量毒物的定量分析。其靈敏度一般較紫外-可見分光光度法高，但濃度太高的溶液會(huì)發(fā)生“自熄滅”現(xiàn)象，而且在液面附近溶液會(huì)吸收激發(fā)光，使發(fā)射光強(qiáng)度下降，導(dǎo)致發(fā)射光強(qiáng)度與濃度不成正比，故熒光分光光度法應(yīng)在低濃度溶液中進(jìn)行。在衛(wèi)生檢驗(yàn)、環(huán)境及食品分析、藥物分析、生化和臨床檢測(cè)等方面有著廣泛的應(yīng)用。
測(cè)定法
熒光分光光度法所用的儀器為熒光計(jì)或熒光分光光度計(jì)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，選定激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)，并制備對(duì)照品溶液和供試品溶液。
通常熒光分光光度法是在一定條件下，測(cè)定對(duì)照品溶液熒光強(qiáng)度與其濃度的線性關(guān)系。當(dāng)線性關(guān)系良好時(shí)，可在每次測(cè)定前，用一定濃度的對(duì)照品溶液校正儀器的靈敏度。然后在相同的條件下，分別讀取對(duì)照品溶液及其試劑空白的熒光強(qiáng)度與供試品溶液及其試劑空白的熒光強(qiáng)度，并用下式計(jì)算供試品濃度：
式中，Cx為供試品溶液的濃度，Cr為對(duì)照品溶液的濃度，Rx為供試品溶液的熒光強(qiáng)度，Rxb為供試品溶液試劑空白的熒光強(qiáng)度，Rr為對(duì)照品溶液的熒光強(qiáng)度，Rrb為對(duì)照品溶液試劑空白的熒光強(qiáng)度。
且因熒光分光光度法中的濃度與熒光強(qiáng)度的線性范圍較窄，故(Rx-Rxb)/(Rr-Rrb)應(yīng)控制在0.5～2之間為宜，如若超過，應(yīng)在調(diào)節(jié)溶液濃度后再進(jìn)行測(cè)定。需要注意的是，當(dāng)濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系明顯偏離線性范圍時(shí)，應(yīng)改用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行含量測(cè)定。
對(duì)易被光分解或弛豫時(shí)間較長(zhǎng)的品種，為使儀器靈敏度定標(biāo)準(zhǔn)確，避免因激發(fā)光多次照射而影響熒光強(qiáng)度，可選擇一種激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)與供試品近似而對(duì)光穩(wěn)定的物質(zhì)配成適當(dāng)濃度的溶液，作為基準(zhǔn)溶液。例如藍(lán)色熒光可用硫酸奎寧的稀硫酸溶液，黃綠色熒光可用熒光素鈉水溶液，紅色熒光可用羅丹明B水溶液等。在測(cè)定供試品溶液時(shí)選擇適當(dāng)?shù)幕鶞?zhǔn)溶液代替對(duì)照品溶液校正儀器的靈敏度。
【附注】
熒光分光光度法因靈敏度高，故應(yīng)注意以下干擾因素。
(1)溶劑不純會(huì)帶入較大誤差，應(yīng)先做空白檢查，必要時(shí)，應(yīng)用玻璃磨口蒸餾器蒸餾后再用。
(2)溶液中的懸浮物對(duì)光有散射作用，必要時(shí)，應(yīng)用垂熔玻璃濾器濾過或用離心法除去。
(3)所用的玻璃儀器與測(cè)定池等也必須保持高度潔凈。
(4)溫度對(duì)熒光強(qiáng)度有較大的影響，測(cè)定時(shí)應(yīng)控制溫度一致。
(5)溶液中的溶氧有降低熒光作用，必要時(shí)可在測(cè)定前通入惰性氣體除氧。
測(cè)定時(shí)需注意溶液的pH值和試劑的純度等對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。
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