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藥典液相色譜方法的調整

根據(jù)藥典附錄“液相色譜法”規(guī)定，可調整適當參數(shù)
    ---調整目的：滿足系統(tǒng)適用性的要求
    ---系統(tǒng)適用性的要求
    ---HPLC方法調整的考慮因素
05版藥典的系統(tǒng)適用性要求
     1、理論塔板數(shù)：
           ----反映整個色譜系統(tǒng)的狀態(tài)
                      填料狀態(tài)
                      管線連接
                ----有不同的計算方法
                     主要是峰寬取值方法不同
                     不同計算方法計算結果有差異
                ----影響因素：
                     被測組分的保留時間、進樣量等
                     積分參數(shù)
                     系統(tǒng)死體積
                     測定色譜方法、樣品與計算方法保持恒定，以便比較
                     
05版藥典的系統(tǒng)適用性要求
     2、分離度：
           ---影響因素：
                     *    影響柱效的因素
                           色譜柱尺寸
                           填料性能
                           進樣量
                     *    影響分離選擇性的因素
                           流動相組成
                           色譜柱品牌
                           柱溫
                      *   柱外體積
                  ---有不同的計算方法，結果有差異
05版藥典的系統(tǒng)適用性要求
  3、重復性（進樣精密度）：
            *   外標法：對照品溶液（n：5）
                       峰面積RSD：2.0%
                 *    內標法：相當于80%，100%，120%的對照品溶液，加入規(guī)定量內標
                                       溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子（n：6）
                       校正因子RSD：2.0%
                 *    手動進樣器：定量環(huán)（滿環(huán)進樣：進樣體積至少為3倍定量環(huán)體積）
                       自動進樣器：準確定量范圍
05版藥典的系統(tǒng)適用性要求
  4、拖尾因子：
            ----影響因素：
                  *    與理論塔板數(shù)相關的因素：
                         色譜柱選擇、流動相、進樣量、積分參數(shù)等
                  *     與檢測品種與方法相關
                  *      峰高法定量分析：0.95~1.05
                     

HPLC方法參數(shù)調整
用規(guī)定的對照品對色譜系統(tǒng)進行試驗，應符合要求。
     如達不到要求，可對色譜分離條件做適當?shù)恼{整。
不得改變：固定相種類，流動相組成，檢測器種類。
可改變：色譜柱尺寸，牌號，填料粒度，流動相流速，流動相各組成的比例，梯度洗脫時間長度，柱溫，進樣量，檢測器靈敏度等
常見的液相色譜參數(shù)的調整：其他參數(shù)
柱溫：升高柱溫有利于改變峰形和分離度，但要注意柱的zui高耐受力
進樣量：在滿足檢測要求的前提下，盡量減少進樣量
供試品溶劑：溶劑強度應等同或低于流動相洗脫強度
反相色譜中溶解樣品的溶劑：
     *    甲醇并不是良溶劑
     *    推薦溶劑
           是流動相
           梯度為起始流動相
           盡可能有水溶液參與
           如果不得不用有機溶劑溶解，盡可能使用小進樣量或兩步稀釋 
常見的液相色譜參數(shù)的調整：流動相
改變溶劑比例：根據(jù)色譜柱類型與狀態(tài)
添加劑
     掃尾劑：有機胺
     緩沖溶液：10-50mM；從20mM開始，越少越好
     離子對試劑：平衡時間長，易在色譜柱中保留
緩沖液pH
     酸含量
     緩沖液的緩沖容量：pKa+-1
     對方法耐用性的影響
常見的液相色譜參數(shù)的調整：固定相
關注不同品牌色譜柱的選擇性差異
      堿性化合物：封端柱、內嵌極性基團柱
      pH耐受范圍
      耐受高水相柱：阿莫西林含量及有關物質的測定
關注色譜柱規(guī)格對分離的影響
     長度：
     內徑：可決定流速
     粒度：越小，柱效越高
     孔徑：與樣品分子量大小相關

藥品雜質分析：雜質定義
任何影響藥品純度的物質
在藥品質量標準中的雜質系指在按照經(jīng)國家有關藥品監(jiān)督管理部門依法審查批準的規(guī)定工藝和規(guī)定的原輔料生產(chǎn)的藥品中，由其生產(chǎn)工藝和原輔料帶入的雜質，或經(jīng)穩(wěn)定性試驗確證的在貯存過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。
藥品質量標準中的雜質不包括：
     *    變更生產(chǎn)工藝或原輔料而產(chǎn)生的新的雜質：重新申報
     *    摻入或污染的外來物：假劣藥品，非法定方法予以檢測
液相色譜法進行有關物質檢查
儀器要求：
      檢測靈敏度
      檢測手段-專屬性
      數(shù)據(jù)處理：積分參數(shù)（zui小峰高和zui小峰面積設定）
已知雜質：采用對照品或相對保留時間定位
專屬性：采用DAD確定UV紫外光譜或不同波長的響應情況
定量：已知雜質雜質：測定對主成分的相對響應因子
                 未知雜質：主成分自身對照法
雜質確定
可用DAD、MSD確定雜質峰的數(shù)目
用空白試驗排除干擾
     *    空白溶劑進樣（考慮進樣溶劑的影響）
     *     運行空白梯度（考慮流動相溶劑質量的影響）
降低系統(tǒng)殘留的影響
     *    手動進樣閥的清洗
     *     自動進樣器應采用洗針進樣模式
考慮色譜分離方法的影響
      *     分離度、進樣量
影響檢測器靈敏度的因素
檢測器
     *    流通池：體積大，靈敏度高
     *     紫外燈能量
     *     采樣頻率：大于15Hz時可準確描述峰
死體積
     *    儀器連接管線應盡量減小柱外體積，避免色譜峰的擴散
     *     運行空白梯度（考慮流動相溶劑質量的影響）
上樣量
流動相：在低波長檢測時，影響大