用噬菌體上清和人血清進(jìn)行ELISA

[器材和試劑]

● 多孔板 （Immuno plate Maxisorp， Nuric）

● 包被緩沖液 （50mmol/L NaHC0₃， pH 9．6，0．05％硫柳汞）

● 單克隆抗體（mAb）57D1。該抗體 能識(shí)別M13噬菌體次要衣殼蛋白（pⅢ）的N末端。它是用M13噬菌體 顆粒免疫大鼠而獲得的。來自含57D1 雜交瘤細(xì)胞的上清用 50％ （NH₄）2SO₄沉淀，然后在PBS中溶 解并透析，zui后抗體在蛋白G—Sepha— rose上免疫純化。

● PBST

● 封閉液（PBS，5％脫脂牛奶，0．05％ Tween—20，0．02％硫柳汞）

● 噬菌體上清

● 細(xì)菌提取物

● PEG—濃縮的nRl—11．1噬菌體

● 來自無關(guān)的大鼠雜交瘤細(xì)胞上清

● AP標(biāo)記的羊抗人IgG Fc—特異性抗體 （Sigma），用封閉液按1：5000比例稀釋

● 底物緩沖液（10％二乙醇胺，0．5mmol/ LMgCl2，0．05％NaN3，用HCl調(diào)節(jié)到 pH 9．8）

● 顯色液（1mg/ml p—硝基苯磷酸的底物 緩沖液）

● 自動(dòng)酶標(biāo)儀

[方法]

1．將200ul濃度為1ug/ml的抗pⅢmAb 57D1①包被緩沖液，分別加在多孔板各個(gè)板孔 中。4℃孵育過夜。

2．棄去包被液，并用PBST洗滌數(shù)次。

3．每孔加250ul封閉液，37℃孵育60分鐘。包被板可立即使用或在一20℃保存數(shù)周。

4．每孔加100ul封閉液和100ul如上述制備的清亮噬菌體上清。在37℃下孵育60分鐘以 使噬菌體顆粒結(jié)合。

5．將人血清在200ul封閉液中，室溫預(yù)孵育30分鐘；其中包含2．5ul細(xì)菌提取物、大約 5 × 10¹⁰pfuPEG—濃縮f1Rl—11．1噬菌體以及10ul來自無關(guān)大鼠雜交瘤細(xì)胞上清。當(dāng) 檢測(cè)單個(gè)克隆時(shí)，采用1：100比例稀釋血清； 當(dāng)檢測(cè)噬菌體文庫(kù)時(shí)，采用1：400比 例稀釋血清。此步可以減少針對(duì)野生型噬菌體的血清抗體、細(xì)菌污染物及大鼠抗pⅢ單 抗的干擾。

6．從包被板中棄去噬茵體上清，并用PBST充分洗滌板孔。

7．在每孔中加200ul預(yù)孵育的血清混合物，在室溫下孵育2小時(shí)。

8．除去血清混合物，用PBST充分洗滌板孔。在每孔中加入200ul堿性磷酸酶標(biāo)記二抗， 室溫孵育60分鐘。

9．除去二抗溶液，并用PBST充分洗滌。用底物緩沖液快速洗滌板孔。

10．在每孔中加200ul顯色液，37℃暗處孵育15—60分鐘。

11．用自動(dòng)酶標(biāo)儀將A₄₀₅和A₆₅₅間的差值作為結(jié)果記錄。

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