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ELISA法檢測立克次體

時間:2009/9/29閱讀:563
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ELISA法檢測立克次體

 

    立克次體(Rickettsia)是一類專性活細胞內(nèi)寄生的原核細胞微生物,具有細胞壁,含有RNADNA,以二分裂繁殖。需在細胞內(nèi)繁殖,不能在無細胞的人工培養(yǎng)基中生長。它是屬于人獸共患的自然疫源性疾病。臨床上常見的有普氏立克次體、莫氏立克次體、恙蟲病立克次體和Q熱立克次體等,它傳播的疾病主要是斑疹傷寒、恙蟲病和Q熱。檢測血清中立克次體的特異性方法包括:免疫熒光法、ELISA、間接血凝法、乳膠凝集法和微量凝集法等。ELISA法特異性強、敏感性高、可重復性好,現(xiàn)已廣泛應用于檢測各種立克次體感染,但其缺點是需要使用純化的抗原。本節(jié)僅對Q熱立克次體抗體ELISA法進行介紹。

    [檢測方法]ELISA

    [方法學原理,  將可溶Q熱立克次體吸附于固相載體上,洗去未吸附的抗原,加入待檢血清使其與載體上吸附的抗體連接,洗滌后加入酶標記的抗人血清球蛋白,溫育后漂洗,加底物溶液,底物降解出現(xiàn)呈色反應,顏色改變的程度與待檢血清的含量成正比。

    [標本準備]

    取新鮮末梢血或靜脈血。如采血后24h內(nèi)不能進行試驗,分離血清后將其保存于-20環(huán)境中。檢測時,使樣本恢復至室溫。

    [試劑]

    1005molLpH 74 PBS-Tween-20

    2001molLpH 96碳酸鹽緩沖液

    3HRP標記抗人球蛋白血清

    4.鄰苯二胺底物溶液

    52molL H2S04

    6.純可溶性Q熱立克次體抗原制備方法見微量凝集試驗檢測Q熱立克次體抗體

    [儀器)  酶標儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀。

    (檢測步驟]

    1.用005molLpH 96碳酸鹽緩沖液稀釋抗原使成每毫升含蛋白101g左右,包被酶標板,每孔02ml,于37環(huán)境中2h后,于4環(huán)境中過夜。

    2.用001molL pH 74 PBS-Tween—203次,用于。

    3.被檢血清經(jīng)含1gL牛血清清蛋白的PBS-Tween-20l200稀釋,加人相應孔中,同時加2孔已知陽性對照和2孔陰性對照,放37環(huán)境中2h。

   4.用0OlmolL pH 74 PBS-Tween—203次,甩干。

    5.加酶標記抗體,每孔02ml37環(huán)境中2h。

    6.用001molL pH 74 PBS-Tween-203次,甩干。

    7.加底物溶液,每孔02ml,室溫避光保存15—30min,各孔加入2moll H2S04 1滴終止反應,用酶標光度計490nm測每孔吸光度值(A。

    (正常參考值]  Q熱立克次體抗體陰性

    [注意事項

    1.可溶性抗原必須純凈,否則影響結果。

    2.每次試驗應同時做2份陽性及2份陰性對照。

    3.其他注意事項同檢測HBsAgELISA。

    [臨床意義]

    1.血清診斷為Q熱zui常用的特異性診斷方法,其特異性很高,未發(fā)現(xiàn)與其他疾病有交叉反應。

2.在發(fā)病過程中,Q熱抗體滴度不斷增長,恢復期抗體水平高于急性期4倍以上,則對確診Q熱有重要意義。

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    3Q熱現(xiàn)癥診斷主要依據(jù)相抗體水平的上升。一般來說,發(fā)病1周左右血清中即有相補體結合抗體出現(xiàn)。若第1相抗體一直保持較高水平,或第1相抗體滴度高于第相滴度,則往往說明感染仍然存在。如患者血清相抗體滴度超過1200提示為慢性Q熱,特別在伴有感染性心內(nèi)膜炎時更有意義。

    41977年,Cracea等提出,在Q熱急性期相抗原的微量凝集試驗陽性率達853%。

 

 

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