豬基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究研究使用

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定豬血清、血漿、唾液、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中MMP-9含量。

概述

    MMP-9基因位于染色體20q11.1~13.1，26~27kbp，具有13個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。哺乳類動(dòng)物MMP-9mRNA的同源性約為80%。MMP-9的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)含有活化蛋白（AP）-1、AP-2和刺激蛋白（SP）-1因子結(jié)合位點(diǎn)，豬的MMP-9啟動(dòng)子區(qū)還有核因子（NF）κB、ETS結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β抑制元件MMPs主要由3個(gè)*的、保守的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，包括前肽區(qū)（氨基末端區(qū)）、催化區(qū)和羧基末端區(qū)（類血紅素結(jié)合蛋白酶區(qū)）。MMP-9是明膠酶中的一種，除了有MMPs的原型結(jié)構(gòu)外，MMP-9的催化區(qū)還包括3個(gè)重復(fù)的型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域與明膠或彈性蛋白有高度的親和力。MMP-9包含一個(gè)V型的膠原蛋白結(jié)構(gòu)域,這個(gè)結(jié)構(gòu)域有高度的糖基化作用，,它影響底物的特異性以及有抗衰變的作用。MMP-9有許多作用底物，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型膠原、蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等，細(xì)胞因子及其受體也是MMP-9作用的底物。

    MMP-9是以酶原的形式從胞內(nèi)分泌到胞外，在體外，MMP-9通過有機(jī)汞制劑反應(yīng)才有活性，在體內(nèi)則可經(jīng)一系列蛋白酶級聯(lián)而激活。這個(gè)膠原蛋白結(jié)構(gòu)域可被MMP-3、MMP-2或者次氯酸裂解，而不是纖維蛋白溶酶、凝血酶或者MMP-1。MMP-3可能是MMP-9zui有效的激活劑。MMP-9主要的循環(huán)抑制劑是а₂巨球蛋白，活化的MMP-9被а₂巨球蛋白捕獲并通過清除受體被清除出循環(huán)系統(tǒng)。金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMPs）是MMPs家族的組織抑制劑，廣泛分布于組織和體液中，共價(jià)結(jié)合MMPs而抑制其活性。TIMP-1作為MMP-9的抑制劑，與MMP-9的酶原或活化后酶的催化區(qū)的羧基末端特異性結(jié)合，形成復(fù)合物，,從而特異性抑制MMP-9的活性。另外，血小板反應(yīng)蛋白和蛋白酶組織抑制因子2（TFPI-2）也能抑制MMP-9的活性。

    MMP-9的生理作用廣泛。MMP能分解呼吸道和肺內(nèi)的結(jié)構(gòu)復(fù)合物如ECM和基底膜,因此能參與呼吸道和肺的重建，它還能調(diào)節(jié)其他蛋白酶及細(xì)胞因子的活性，它能降解α₁抗胰蛋白酶，保護(hù)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性,能加強(qiáng)膠原質(zhì)膠體中膠原細(xì)胞和MMP-13的溶膠原活動(dòng)，并且MMP-9還能從白細(xì)胞介素8（CXCL8/CL8）上分解一個(gè)62氨基酸肽,使其向中性粒細(xì)胞的趨化活性增加10倍，但它也抑制其他中性粒細(xì)胞的趨化因子。此外，MMP-9結(jié)合CD44可釋放儲(chǔ)存的TGF-β1，另外，MMP-9可通過釋放血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）以參與血管生成。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中MMP-9水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入MMP-9抗原、生物素化的抗大鼠MMP-9抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MMP-9呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為20000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成20000 pg/mL，10000 pg/mL ，5000 pg/mL，2500pg/mL，1250pg/mL，625 pg/mL，312.5 pg/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         抗體稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         抗體稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以抗體稀釋液A1：100稀釋。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以抗體稀釋液B1：100稀釋。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標(biāo)本的采集及保存

1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul，輕輕混勻，37℃，120分鐘。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘。

6.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層

吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
    自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的豬MMP-9，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)

1．  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

3．  請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

4．  如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計(jì)算時(shí)請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時(shí)，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

6．底物請避光保存。

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

2．有效期：6個(gè)月

3．濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

4．中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。

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