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蛋白質新技術
點擊次數(shù)：3411 發(fā)布時間：2011-3-7
蛋白質這一新技術為科研人員深入了解活細胞中蛋白質組半衰期動力學開辟了新途徑。
清除不必要或有害的蛋白質是細胞進行自身調控的重要途徑之一。在生物體中主要通過兩種機制來實現(xiàn)：一種是通過蛋白酶體降解蛋白質，而另一種則是以細胞生長的方式對細胞內的蛋白質進行稀釋?？焖俜至训募毎缂毦饕且蕾?ldquo;稀釋”的方式，而終末分化的哺乳動物細胞則主要是通過蛋白質降解的途徑。“由于蛋白質的清除途徑通常取決于細胞的類型，科學家們常常忽略了降解和稀釋之間存在的平衡關系
脈沖追蹤術和蛋白質合成抑制法來檢測蛋白質的降解速率。盡管脈沖追蹤術已被應用了數(shù)十年，然而由于這種方法需要使用放射性標記和蛋白特異性抗體，使其應用范圍受到很大的限制；而蛋白質合成抑制劑則有可能會擾亂細胞的功能
在這篇文章中研究人員開發(fā)了一種檢測蛋白質半衰期的新技術，將其命名為“漂白追蹤”（bleach-chase）術。他們首先利用熒光YFP標簽標記目的蛋白，進而利用短暫的閃光脈沖使10-60%的熒光基因失去熒光（即所謂“漂白”）,由于時間短暫因此不會對細胞造成影響。
“漂白促使標記蛋白分為了兩種亞群：熒光蛋白和非熒光蛋白。而理論上漂白后細胞不會再合成新的非熒光蛋白，熒光的衰減則只可能是依賴于蛋白質清除，”Eden解釋說：“我們利用熒光時差顯微術對漂白細胞和非漂白細胞進行了觀測，通過比較兩種細胞中的熒光水平改變從而獲得了非熒光蛋白的動力學數(shù)據(jù)。”
‘漂白追蹤’術除了能準確定量蛋白質的半衰期，還能幫助科學家鑒別哪些蛋白發(fā)生了活性降解，哪些蛋白則隨細胞分裂而發(fā)生了稀釋，”Eden說：“我們在試驗中針對人類癌細胞中100種不同的蛋白質進行了降解和稀釋分析，發(fā)現(xiàn)在檢測時間段中48%的蛋白質出現(xiàn)了降解，10%的蛋白質發(fā)生了稀釋，而42%的蛋白則同時存在降解和稀釋。”
在進一步的研究中，Eden等利用一種化療藥物對細胞施加壓力以減慢細胞的生長速率，觀測這一效應對于蛋白質清除的影響。研究人員觀察到盡管短半衰期蛋白質沒法發(fā)生變化，但長半衰期蛋白質則經過更長時間的稀釋在更大程度上被清除。當他們檢測以不同速率減慢細胞生長的其他壓力時，觀察到了相同的效應。“我們認為這是一種相當普遍的現(xiàn)象，”Eden說：“這一簡單原理幫助我們更深入地了解了對應不同壓力時蛋白質清除率變化。值得注意的是，研究結果表明細胞并沒有利用蛋白質降解來補償稀釋率的變化。
“相比于常規(guī)的脈沖追蹤術完成這些試驗非常的簡單，并且可以更快速地生成結果。它使得科學家們能夠真正實現(xiàn)大規(guī)模蛋白質半衰期檢測，”Eden指出：“然而其存在的*缺點就是蛋白質必須首先進行熒光標記，這有可能會對細胞內的蛋白質清除產生影響，但我們已非常小心的利用脈沖追蹤對比試驗排除了這種可能性。”
相信隨著熒光標記蛋白庫日益廣泛地應用于越來越多的生物體，這項新技術也將顯示出更加廣泛的用途。