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細(xì)菌中分離純化質(zhì)粒DNA
點(diǎn)擊次數(shù)：1516 發(fā)布時(shí)間：2012-1-6
1. 細(xì)胞壁的消化，將細(xì)菌溫育在裂解液中去除細(xì)胞壁中的肽聚糖。通常在等滲的情況下進(jìn)行此步，以防止細(xì)胞漲破釋放出染色體DNA分子。注意，革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)裂解酶相對(duì)不敏感，需要額外的處理以使酶到達(dá)細(xì)胞壁層，例如，可采用滲透壓休克或保溫在螯合劑中，如EDTA。EDTA也能使一些細(xì)菌的脫氧核糖核酸酶失活，以防止在提取過(guò)程中，質(zhì)粒DNA降解。
2. 利用強(qiáng)堿（NaOH）和其他試劑，如十二烷基磺酸鈉溶解細(xì)胞膜并使蛋白質(zhì)部分變性。再中和此溶液使不溶性染色體DNA沉淀，質(zhì)粒DNA存于溶液中。
3. 移去其他的大分子物質(zhì)，特別是RNA和蛋白質(zhì)，這可利用核糖核酸酶和蛋白酶進(jìn)行酶促消化。另一些化學(xué)純化步驟可增加質(zhì)粒DNA的純度，例如可將提取物同水飽和酚或酚/氯仿混合物混合，以除去蛋白質(zhì)。再離心，DNA留在上面的水層，蛋白質(zhì)則分離在下面的有機(jī)溶劑層。重復(fù)酚/氯仿提純的循環(huán)可降低樣品中這些大分子蛋白的含量到zui少。還可通過(guò)等密度的CsCl梯度離心法得到純化的DNA。
4. 利用體積分?jǐn)?shù)為70%左右的乙醇沉淀DNA，離心，得到的DNA沉淀，再用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗，其中的水將除去先前階段的鹽污染。經(jīng)過(guò)提純的DNA，可冷凍保存?zhèn)溆茫蛑匦氯芙庠诰彌_液中。