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大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化方法
點擊次數(shù)：1337 發(fā)布時間：2013-1-8
*天：
1. 將適合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，在37°C下過夜培養(yǎng)
2. 高溫滅菌大的離心瓶（250-500ml）以備第二天搖瓶用
3. 準(zhǔn)備幾瓶滅菌水（總量約1.5升），保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細(xì)胞用
第二天：
4. 轉(zhuǎn)移0.2-1ml過夜培養(yǎng)物至裝有500ml LB（或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基）的1-2升搖瓶
5. 37°C下劇烈振蕩培養(yǎng)2-6小時
6. 定時監(jiān)控OD600值（培養(yǎng)1小時后每半小時測定一次）
7. 當(dāng)OD600值達(dá)到0.5-1.0時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻至少15分鐘（需要的話這種方式可以存放培養(yǎng)液數(shù)小時）
8. 細(xì)胞在4°C 5000g下離心15分鐘，棄上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一兩天）
9. 用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細(xì)胞于少量體積中（幾毫升），然后加水稀釋至離心管的2/3體積。
10. 照上面步驟重復(fù)離心，小心棄去上清液
11. 照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞
12. 離心，棄上清液
13. 用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細(xì)胞
14. 照上面步驟離心，小心棄去上清液（沉淀可能會很松散）
15. 用10%甘油重懸浮細(xì)胞至zui終體積為2-3ml
16. 將細(xì)胞按150μl等份裝入微量離心管，于-80°C保存
轉(zhuǎn)化方法：
1. 在冰上解凍電感受態(tài)細(xì)胞添加1-10μl DNA，冰上培育約5分鐘
2. 添加1-3μl DNA，冰上培育約5分鐘
3. 轉(zhuǎn)移DNA/細(xì)胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器（無泡）中
4. 加載P1000，準(zhǔn)備好300μl LB 或 2xYT
5. 對電穿孔容器進(jìn)行脈沖（200 歐姆， 25μFd，2.5 千伏）（檢查時間常數(shù)，應(yīng)該在3以上）
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至電穿孔容器中
7. 37°C下培養(yǎng)細(xì)胞40分鐘至1小時以復(fù)原
8. 轉(zhuǎn)移細(xì)胞至適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)