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利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期時(shí)相
點(diǎn)擊次數(shù)：1417 發(fā)布時(shí)間：2013-1-11
詳情請(qǐng)看：利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期時(shí)相
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/font>
掌握流式細(xì)胞儀的工作原理
掌握用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞群體DNA含量分布的方法
了解流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用
二、實(shí)驗(yàn)原理
流式細(xì)胞儀的工作原理是將待測(cè)細(xì)胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進(jìn)入充滿鞘液的流動(dòng)室。在鞘液的約束下細(xì)胞排成單列由流動(dòng)室的噴嘴噴出，形成細(xì)胞柱。通過(guò)對(duì)流動(dòng)液體中排列成單列的細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)，得到該細(xì)胞的光散射和熒光指標(biāo)，分析出其體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學(xué)特征。
細(xì)胞內(nèi)的DNA含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI標(biāo)記的方法，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，可分析細(xì)胞周期各時(shí)相的百分比。
三、儀器、材料與試劑
儀器：流式細(xì)胞儀，細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，離心機(jī)，水浴，冰箱
材料：HeLa細(xì)胞，5ml注射器，離心管，封口膜，微量移液器，Tips
試劑：70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-20℃保存）
PI （650µg/ml，避光保存于-20℃），PBS（pH 7.4，保存于4℃）
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，胰酶適度消化細(xì)胞，用培養(yǎng)液吹打，800rpm , 離心 15 min去上清。
2、PBS洗2次，加0.5mL PBS吹勻，務(wù)必吹散。
3、用5mL注射器將細(xì)胞吸起，用力打入5mL 70%（預(yù)冷）乙醇中，封口膜封口。4℃固定過(guò)夜（可長(zhǎng)至2周）
4、800rpm 15min收集固定細(xì)胞，PBS洗2次
5、用0.4mL PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)至Tube中輕輕吹打（防止細(xì)胞破碎）
6、加RNase-A約3µL至終濃度約為50µg/mL ，37℃水浴消化30 min；
7、加PI約50µL至終濃度約為65µg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。
8、用300目（孔徑40~50微米）尼龍網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)。
9、樣品分析測(cè)定及打印。