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酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA資料
最近更新時(shí)間：2011-3-7
提 供 商：上海研生實(shí)業(yè)有限公司資料大?。?/span>0K
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ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行,在目前的以HRP作為標(biāo)記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以O(shè)PD為底物，則試劑盒提供OPD 片劑或粉劑，臨用前配制。一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15~30min。從理論上說(shuō)，37℃30min才可以使HRP的底物催化反應(yīng)*，盡管在zui初的10min內(nèi)，絕大部分催化反應(yīng)即可完成。因此，為使弱陽(yáng)性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應(yīng)25~30min后，終止反應(yīng)比色測(cè)定。
比色測(cè)定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。由于有的臨床實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行ELISA測(cè)定時(shí)，以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問(wèn)題。
單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇的問(wèn)題。中檔以上的酶標(biāo)儀基本上都同時(shí)具有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)比色功能。所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有zui大吸收的波長(zhǎng)如 450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)比色則是酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定1次，敏感波長(zhǎng)下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。
zui后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非敏感波長(zhǎng)下的吸光度值的差。因此，雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)，一般不必設(shè)空白孔。如在使用雙波長(zhǎng)比色時(shí)，仍設(shè)空白孔，就可能會(huì)造成前面提到的測(cè)定孔吸光度為負(fù)數(shù)的現(xiàn)象。由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收具有一定程度的不確定性，也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí)，是使用雙波長(zhǎng)比色。