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上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司
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proaxsis ProteaseTag ® 主動(dòng)彈性蛋白酶免疫操作指南
ProteaseTag® Active Neutrophil Elastase Immunoassay
免疫測(cè)定分為兩個(gè)部分：
1）一個(gè)較大的盒子[58 cm x 38 cm x 35 cm; 體重±10公斤（體重主要是由于凝膠袋）]，其包含需要保持在4℃冷卻并且必須投入在接收到冰箱的液體瓶，
和
2）一個(gè)小的內(nèi)“冷凍箱” [39厘米× 27厘米x 28厘米; 重量±7公斤（重量主要?dú)w因于干冰）]，我們?cè)诟杀蠁为?dú)發(fā)送。
因此，每個(gè)套件將[快遞]分2個(gè)單獨(dú)的包裹寄送，總重為±17公斤。
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試劑盒內(nèi)容物
冷凍箱組件 |
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NE標(biāo)記 | 1小瓶含4µl（濃度10 mM）捕獲探針 N,N-二甲基甲酰胺(DMF) |
人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品 | 2瓶含6µl天然NE（濃度100µg/ml）的酸性緩沖液 |
NE結(jié)合物 | 1瓶含25µl 穩(wěn)定性溶液中與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合的抗人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體 |
主要試劑盒組分 |
|
免疫分析板 | 96孔鏈霉親和素包被微量滴定板（預(yù)封閉） |
NE清洗緩沖液A濃縮液 | 24 mL 25倍濃度的緩沖表面活性劑（含防腐劑） |
NE洗滌緩沖液B濃縮液 | 8 mL含防腐劑的25倍濃度緩沖液 |
NE標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑 | 15 mL含防腐劑的緩沖液（即用型） |
NE試劑稀釋劑 | 2 x 13 mL含防腐劑的緩沖表面活性劑（即用型） |
TMB底物 | 12 mL四甲基聯(lián)苯胺（即用型） |
終止液 | 6 mL 2N硫酸（即用型） |
封板機(jī) | 4個(gè)粘合條 |
需要但未提供的材料
- 去離子水或蒸餾水
- 經(jīng)校準(zhǔn)的移液器和相應(yīng)的移液器吸頭
- 試管和試管架
- 清潔稀釋清洗緩沖液的容器
- 渦旋
- 培養(yǎng)箱(37 ℃)
- 能夠在450 nm處讀數(shù)的經(jīng)校準(zhǔn)的微量滴定板讀數(shù)器
試劑制備
除標(biāo)準(zhǔn)品和樣品外，所有試劑均應(yīng)在使用前恢復(fù)至室溫。使用前，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須始終置于冰上。
提供了足夠的試劑，可獲得兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
_清洗緩沖液A-用576 mL去離子水稀釋24 mL濃縮液，制成600 mL清洗緩沖液A
_清洗緩沖液B–量取8 mL濃縮液，加入192 mL去離子水中，制成200 mL清洗緩沖液B
_NE結(jié)合物–用11980µl NE試劑稀釋劑稀釋20µl NE結(jié)合物，制備12 mL結(jié)合物溶液（600倍稀釋）
_NE-Tag–用11997.6µl NE試劑稀釋劑稀釋2.4µl NE-Tag，制備12 mL NE-Tag溶液（5000倍稀釋）
_標(biāo)準(zhǔn)品-
- 移取495µl NE標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至一個(gè)微量管中
- 移取250µl NE標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至6個(gè)后續(xù)微量管中
- 向試管中加入5µl NE標(biāo)準(zhǔn)品。從一個(gè)試管移取250µl至下一個(gè)試管，進(jìn)行連續(xù)稀釋。轉(zhuǎn)移至下一試管前，充分混勻各試管。這將創(chuàng)建具有以下NE濃度的校準(zhǔn)曲線：1000、500、250、125、62.5、31.25和15.625 ng/mL
- 使用NE標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑作為零（空白）標(biāo)準(zhǔn)品
_樣品-使用NE標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑適當(dāng)稀釋。
試驗(yàn)程序
所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均應(yīng)重復(fù)測(cè)定兩次。
- 按照上文所述制備所有試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。建議在加至微孔板之前立即制備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品
- 從鋁箔袋中取出平板
- 使用300µl/孔清洗緩沖液A抽吸并清洗每個(gè)孔。重復(fù)該程序兩次，共
3次清洗
- 向各孔中加入100µl稀釋的NE-Tag。用封板覆膜覆蓋，并在37 ℃下孵育30 min
- 使用300µl/孔清洗緩沖液B抽吸并清洗每個(gè)孔。重復(fù)該步驟兩次，總計(jì)
3次清洗
- 向各孔中加入100µl稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和空白。用封板覆膜覆蓋，并在37 ℃下孵育30 min
- 使用300µl/孔清洗緩沖液A抽吸并清洗每個(gè)孔。重復(fù)該程序兩次，共
3次清洗
- 向每個(gè)孔中加入100µl稀釋的結(jié)合物。用封板覆膜覆蓋，并在37 ℃下孵育60 min
- 使用300µl/孔清洗緩沖液A抽吸并清洗每個(gè)孔。重復(fù)該程序兩次，共
3次清洗
- 每孔加入100µl TMB底物溶液。用封板覆膜覆蓋，并在37 ℃下孵育10 min。避光保存
- 向各孔中加入50µl終止液。孔內(nèi)顏色應(yīng)從藍(lán)色變?yōu)辄S色
- 在15 min內(nèi)使用設(shè)置為450 nm的酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔的光密度。
結(jié)果計(jì)算
計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品重復(fù)兩次讀數(shù)的平均值，并從終結(jié)果中減去零空白。通過(guò)生成log x-軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將曲線擬合為樣條曲線或4參數(shù)邏輯擬合。如果樣品已被稀釋，則應(yīng)根據(jù)稀釋因子校正報(bào)告的濃度。
檢測(cè)試劑盒的局限性
正確存儲(chǔ)所有組件(_s)
_使用所有未開(kāi)封的試劑在其有效期內(nèi)
_請(qǐng)勿與其他批次或來(lái)源的試劑混合或替代
_所有程序均應(yīng)按照方案進(jìn)行
_如果樣品產(chǎn)生的結(jié)果高于高標(biāo)準(zhǔn)品，則應(yīng)使用NE標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品并重復(fù)。
技術(shù)提示
_本試劑盒僅供有資質(zhì)的人員使用
_按照國(guó)家和當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)以安全方式處置容器和未使用的內(nèi)容物
_為避免交叉污染，在添加各標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑之間更換移液器吸頭。此外，每種試劑使用單獨(dú)的儲(chǔ)液器
_為確保結(jié)果準(zhǔn)確，在孵育步驟期間必須適當(dāng)粘附封板覆膜
_囊性纖維化患者痰液或支氣管肺泡灌洗液(BALf)用NE標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋至少100倍。COPD樣本的建議起始稀釋度為10倍
