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CRISPR-Cas9的改良技術(shù)
-- 細(xì)胞特異性敲除與miNRA-Cas9開(kāi)關(guān)
近日,日本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表了有關(guān)miRNA-Cas9開(kāi)關(guān)與細(xì)胞特異性敲除的報(bào)告,他們將Trilink的修飾NTPs 結(jié)合到定制的Cas9 mRNA中,用于優(yōu)化CRISPR Cas9 基因編輯在細(xì)胞特異性中的應(yīng)用。
目前,以DNA為基礎(chǔ)的基因編輯發(fā)展迅速,尤其是CAR-T療法(Novartis’ Kymriah 和 Gilead’s Yescarta)。但在某些應(yīng)用程序中,成功的限制性因素在于其以細(xì)胞類(lèi)型*的方式運(yùn)作的能力。研究小組選擇了一種基于RNA的傳遞系統(tǒng),以克服一些以DNA為基礎(chǔ)的系統(tǒng)相關(guān)的安全問(wèn)題,包括基因組整合系統(tǒng)的安全問(wèn)題等。
研究報(bào)道:為了調(diào)控Cas9的核酸內(nèi)切酶活性,已有幾種方法,包括光或小分子蛋白誘導(dǎo)系統(tǒng)、組織特異性啟動(dòng)子系統(tǒng),和采用split-cas9的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)電路。但這些報(bào)導(dǎo)主要都是使用DNA傳遞方法。
該研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一個(gè)基于mRNA的Cas9開(kāi)關(guān),該開(kāi)關(guān)是由具細(xì)胞特異性的microRNA(miRNA)調(diào)控。具體來(lái)說(shuō),他們引進(jìn)了miRNA的互補(bǔ)序列到Cas9 mRNA的5'端非編碼區(qū)(見(jiàn)圖1),假設(shè)通過(guò)檢測(cè)異質(zhì)性細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性miRNA水平,可以選擇性地控制基因組編輯。當(dāng)靶基因miRNA缺乏時(shí),Cas9蛋白被翻譯表達(dá),當(dāng)靶基因miRNA存在時(shí),該蛋白翻譯表達(dá)被抑制。
研究報(bào)告顯示,他們miRNA-cas9開(kāi)關(guān)有效地和選擇性地響應(yīng)了HeLa細(xì)胞中的miRNA。同時(shí),使用不同的標(biāo)記mRNA,在人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)中都可看到類(lèi)似的結(jié)果。
另外,使得驚喜的是,此系統(tǒng)也能夠區(qū)分誘導(dǎo)和分化的神經(jīng)元細(xì)胞胞,此功能可能將在臨床應(yīng)用中起重要作用。
同時(shí),為進(jìn)一步優(yōu)化相關(guān)領(lǐng)域,他們提出,可通過(guò)含有多個(gè)miRNA開(kāi)關(guān)的Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn),例如減少泄漏表達(dá)等。
研究小組得出結(jié)論:系統(tǒng)應(yīng)適用于其他Cas9變異(例如同源基因工程蛋白Cas9 / dCas9)和其他miRNA的即插即用方式。”這個(gè)功能和易用性可以很好地改良CRISPR-Cas9技術(shù)。
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