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2012-2-3 閱讀(1325)
克隆技術(shù)(DNA連署)
利用DNA 連署酶把載體 DNA 和要克隆的目標(biāo) DNA 斷片連署在一塊兒，變成一個完整的重組分子，這就是分子克隆中等說的連署反響。當(dāng)載體 DNA 和外源 DNA 末端都是由一種萌生粘性末端的內(nèi)切酶割切萌生的話(同尾酶也可以)，還是兩者末端被接上一段互補(bǔ)的多聚體的尾巴，那末經(jīng)退火后可形成新的重組分子。連署后萌生的重組分子中還是保存著外源 DNA 兩端的限止性內(nèi)切酶切點(diǎn) ，因此使我們能便捷地從重組分子再次抽取所克隆的DNa段。
試藥與器具材料
l ．試藥
(l )T4 DNA 連署酶稀釋液： 50mmol / L Tris-Cl ，pH7.5 ，500μg/ml BSA (牛血清白蛋白)。
(2 )外源 DNA(P-DNA): AcNPV 變株 m29DNA 的 BamHI 割切萌生的 F 斷片，分子量約 1.9 kb ，液體濃度 1μl=5ng 。
(3 )10 ×連署反響液： 700 mmol / L Tris-HCl ，pH7.5 ，70mmol / L MgCl2 ，0.7mmol / L ATP 。
(4 )載體 DNA(V-DNA): M12 mp19RF DNA ，經(jīng) BamHI 割切 ,分子量約 7.2kb ，液體濃度約 lμl ＝10 ng 。
2.器具材料； 恒溫水浴器、真空干燥箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、生化培養(yǎng)箱、離心機(jī)等。
[操作] (1 )取 3 支 eppendorf 離心管，標(biāo)上 1 、2 、3 號。 (2 )順次加水、V-DNA ，在 2 ，3 號管加 P-DNA 。 (3 )離心 3 秒，置 65 ℃干燥箱 10 分鐘，而后抽取插進(jìn)去冰中。 (4 )用 T4 DNA 連署酶稀釋液把 T4 DNA 連署酶稀釋至 0.2 U / ml 。 (5 )按表中所示的量參加 10 ×緩和沖突液，在 1 及 3 中加連署酶。 (6 )混勻，離心3 秒鐘，置 12 ℃恒溫水浴過夜。第二天抽取，如不做轉(zhuǎn)染放 -20 ℃保留。2 和 1 為對照，以查緝 V-DNA 的酶切效果和連署酶連署效果。 如今寶靈曼企業(yè)已推出迅速連結(jié) DNA 試藥盒。該試藥盒能在室溫下 5 分鐘內(nèi)將粘性末端或男子發(fā)式末端斷片連署。施行反響需求的全部試藥已涵蓋在試藥盒內(nèi)。
