轉基因復印數熒光定量PCR辦法
挑選一種合宜的陽性標準品來畫出標準曲線，是應用實時熒光定量 PCR 技術正確認量模型板起初液體濃度的基礎。近年來，國里外的科學家做了不一樣的試驗。Song(2002)等覺得理想的標準品應當是已插進去外源基因的植物基因組DNA ，況且用Southern blot正確測得插進去的外源基因復印數。不過在實際研討中，很不容易得到到這么一套標準品。因為這個，他提出代替方案，依據外源基因復印數和野生型植物 DNA 的體積，按一定液體濃度比值混合，制成標準曲線。例如，在玉茭的外源基因復印數研討中它們發(fā)覺，在參加熒光染布材料SYBR GREEN I的20 μL PCR反響整體體系中，應以6 ng野生型玉茭基因組DNA 作為模型板量。已知玉茭基因組DNA 體積為2.5 × 10.9 bp(Armuganathan和Earle 1999)，相應于6 ng的玉茭DNA ，即可計算出摹擬1、2、4、8、16個外源基因復印時，應參加的質粒 DNA 的量。
利用新式、銳敏、高通量的實時熒光定量PCR辦法可以用于標定原始品系中轉基因的*復印數。實時熒光定量PCR技術是一種較新的DNA 定量辦法。其定量的基本原理是在PCR反響整體體系中參加非特別優(yōu)異性的熒光染布材料(如：SYBR GREEN I)或特別優(yōu)異性的熒光探針(如：Taqman 探針)，實時檢驗測定熒光量的變動，取得不一樣樣品達到一定的熒光信號(閾值)時所需的循環(huán)回數：CT值(Cycle Threshold)；經過將已知液體濃度標準品的CT值與其液體濃度的對數畫出標準曲線，就可以正確認量樣品的液體濃度。熒光定量 PCR 技術具備簡單方便、敏捷的長處，能夠管用擴增低復印的靶斷片DNA ，對每克樣品中20 pg-10 ng的轉基因成分施行管用檢驗測定。同時，與Southern法相形，熒光定量PCR技術可對T-DNA 的不一樣序列施行擴增，因為這個能成功實現對品系中的基因重組的檢驗測定干燥箱KLYQ、生化培養(yǎng)箱。
以這些個梯度混合液作為標準品，就可畫出標準曲線，檢驗測定樣品的液體濃度并計算插進去的復印數了。實驗表明，用這種辦法取得的數值和 Southern blot 的zui后結果相當*一樣。Giovanna(2002)將農桿菌介導的轉基因西紅柿作為研討材料，挑選了雙元載體T-DNA 區(qū)上的兩個外源基因TSWV-N(Tomato spotted wilt virus)、nptⅡ(neomycin phosphoril-transferaseⅡ)和一個單復印的內源基因(endogenous gene)作為熒光定量PCR擴增的模型板，檢驗測定外源基因復印數。他覺得運用植物基因組 DNA 和一定比例質粒的混合液作為標準品，會累積很多沒有辦法防止的誤差。譬如運用這種標準品不可少預先曉得待測植物基因組 DNA 的非常準確分子量，并對植物 DNA 和質粒正確認量，但在大部分數事情狀況下獲得的數值都只是近似商，再以資混合液作為標準品檢驗測定每一植株的外源基因復印數時，便會放大這些個誤差。
因為這個，他提出“相對CT”或“δ-δCT”的辦法，這個辦法的長處是不必為每每實驗制造標準曲線，只消一個優(yōu)化步驟證實外源基因與內源基因有相同的，至少是相仿的反響速率即可。與其他定量技術如 Southern Blot 相形，實時定量 PCR 技術的特別優(yōu)異性和高信嗓比特別的性質為轉基因復印數定量供給了一點便捷。與實時定量 PCR 相形，DNA 點雜交技術要消耗的錢價不低的試藥、勞力以趁早間。每個條帶至少需求2微克的 DNA 用于放射性檢驗測定或是至少 10 微克用于熒光檢驗測定，因為這個，需求數量多的團體樣品，實驗務必等到每個植株通過傳代能夠供給足夠數目的團體后才可以用于檢驗測定復印數。電熱恒溫鼓風干燥箱、干燥箱KLYQ、培養(yǎng)箱KLYQ。
假如存在重組的話，zui后結果將更為復雜。定量PCR剖析的轉基因復印數稍高于Southern Blot的剖析zui后結果，主要端由是Southern Blot辦法在同一個插進去位點有多復印的T-DNA 斷片插合乎時尚，轉基因植株的在酶切特殊情況萌生相仿的DNA 斷片，電泳剖析時很難分清。定量PCR辦法則防止了這種事情狀況的發(fā)生，錯非目標基因DNA 斷片在PCR引物處發(fā)生斷開。兩種辦法剖析zui后結果的比較顯露定量PCR辦法剖析復印數更加管用、適合使用。
