ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)配備的Zeno Trap（Zeno阱）功能激活后，可以使SWATH DIA工作流程中的肽段二級質(zhì)譜靈敏度提高5-6倍左右，使得蛋白質(zhì)組學工作流程平臺中使用納克甚至皮克級樣品量成為可能。我們應用Zeno SWATH IDA流程，對低進樣量K562樣品進行分析，使用納升液相系統(tǒng)進行蛋白質(zhì)鑒定和定量測試，并且評價了DIA-NN中使用基于自建數(shù)據(jù)庫和非自建庫的分析流程。
液相方法：液相系統(tǒng)：M Class系統(tǒng)（Waters），色譜柱：EV-1106 色譜柱，15 cm x 150 μm，1.9 μm 粒徑，流速：300 nL/min，梯度：45min。
質(zhì)譜方法：質(zhì)譜：ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)，采集模式：Zeno SWATH DIA，可變窗口數(shù)：80個（m/z 400-903），一級累積時間：50毫秒，二級累積時間：18毫秒，源氣參數(shù)：離子源電壓3200 V，溫度225°C，Gas1 ：10 psi ，CUR gas ：20 psi。
數(shù)據(jù)分析：Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)使用DIA- NN軟件處理，分別使用自建數(shù)據(jù)庫和非自建庫流程，自建數(shù)據(jù)庫為之前由OneOmics建立的人細胞裂解液數(shù)據(jù)庫。
主要結(jié)果：
1.
低進樣量時蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)量
在不同進樣量時測試蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)量，可以看到在250 pg進樣量時，K562樣品可以鑒定到880個蛋白質(zhì)( FDR<1%)，其中327個蛋白質(zhì)CV低于20% ( 圖1)。隨著樣品進樣量的增加，蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量增加，進樣5ng時鑒定出3752個蛋白( FDR<1%)，其中2457個蛋白CV低于20%。空白樣品按照相同條件進行分析，未檢測到蛋白或多肽，說明工作流程可靠性。
圖1. 不同低進樣量樣品中蛋白質(zhì)（左）
和肽段（右）的鑒定和定量數(shù)量
左圖透明柱狀圖代表global FDR<1%時蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量，實心柱狀圖代表FDR <1%和CV <20%的可定量蛋白質(zhì)數(shù)量。
2.
采用自建數(shù)據(jù)庫和非自建庫時蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量對比
使用DIA-NN分別進行基于自建數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)處理，以及直接從人類FASTA文件中生成理論數(shù)據(jù)庫的分析。總體而言，兩種數(shù)據(jù)處理方法蛋白質(zhì)鑒定的重疊程度很高，使用自建數(shù)據(jù)庫處理的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量略多(約4%)（圖2），二者共同鑒定到的蛋白質(zhì)為819個。
圖2. 使用數(shù)據(jù)庫與非數(shù)據(jù)庫分析流程中
蛋白質(zhì)鑒定數(shù)的對比
3.
Zeno SWATH IDA流程穩(wěn)定性測試
通過比較間隔1個月進樣的2組實驗來評估低進樣量實驗的日間重復性，每次實驗對相同的K562原液進行稀釋，使用Zeno SWATH DIA進行分析?？梢钥吹?，在3種低進樣量下，觀察到相近的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量（圖3）。
圖3. 用獨立稀釋的K562樣品進行不同時間的比較
兩組實驗中，每個進樣量樣品均進行3次采樣。數(shù)據(jù)在DIA-NN軟件中使用基于自建數(shù)據(jù)庫的流程進行數(shù)據(jù)處理。透明柱狀圖表示global FDR <1%的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)，實心柱狀圖帶表示FDR <1%和CV <20%的可定量蛋白質(zhì)數(shù)。
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