通常使用方便的多孔板來(lái)分析細(xì)胞在靜態(tài)條件下對(duì)固定化分子的粘附，通常由于洗滌板時(shí)通常產(chǎn)生的不受控制的剪切力是困難的。
清洗室允許多孔板的孔在液體充滿的環(huán)境中通過(guò)倒置來(lái)清洗。未結(jié)合的細(xì)胞通過(guò)重力從孔中分離，由此消除剪切以及粘附細(xì)胞通過(guò)液體/空氣界面。

在靜態(tài)條件下測(cè)量細(xì)胞粘附

John L. Magnani?GlycoTech Corporation，Rockville，Maryland 20850

任何不同的分子已被描述為促進(jìn)包括幾個(gè)細(xì)胞表面碳水化合物結(jié)合蛋白的細(xì)胞粘附。由于通過(guò)洗滌孔產(chǎn)生的剪切力，在方便的96孔微量滴定板形式中測(cè)量細(xì)胞粘附是困難的。該協(xié)議引入使用充滿液體的洗滌室，其通過(guò)重力分離未結(jié)合的細(xì)胞，由此消除不受控制的剪切力和粘附細(xì)胞通過(guò)液體/空氣界面的通道。雖然也可以使用放射性標(biāo)記物等其他方法，但為了檢測(cè)，用熒光染料（6-羧基熒光素二乙酸酯）裝載細(xì)胞。該方案對(duì)于分析促進(jìn)或抑制細(xì)胞粘附的分子也是有用的。

 

材料：

靜態(tài)細(xì)胞粘附洗滌室 測(cè)試懸浮的細(xì)胞 測(cè)試細(xì)胞粘附分子 6-羧基熒光素二乙酸酯 微量滴定板（96孔） 自動(dòng)96孔板清洗機(jī)（可選） 微孔板熒光讀板器 HEPES緩沖液為CaMg：（0.05M HEPES，0.15M的NaCl，1mM的氯化鈣2，1毫摩爾MgCl 2，pH7.4）中 牛血清白蛋白（BSA） RPMI 1640培養(yǎng)基 熒光測(cè)量系統(tǒng)的微量滴定板

 

協(xié)議：

1.將細(xì)胞粘附分子與100ng HEPES CaMg緩沖液中的200ng細(xì)胞粘附分子一起孵育2小時(shí)，將96孔微量滴定板包上細(xì)胞粘附分子。在37℃下。

2.通過(guò)加入100μl2％BSA的HEPESCaMg /孔，進(jìn)一步阻斷塑料孔的非特異性結(jié)合。在室溫下孵育1小時(shí)。

3.用HEPESCaMg緩沖液手動(dòng)或使用96孔自動(dòng)洗板機(jī)清洗微量滴定板。

4.用100μl含有1％BSA的HEPESCaMg緩沖液填充孔或在每孔中加入100μl含有1％BSA的HEPESCaMg緩沖液中的細(xì)胞粘附試驗(yàn)抑制劑并溫育2小時(shí)。在室溫下。

5.在培養(yǎng)期間，用6-羧基熒光素二乙酸酯（6-CFDA）負(fù)載測(cè)試細(xì)胞如下：

A.用RPMI 1640清洗細(xì)胞懸液

B.將細(xì)胞重懸于4.8ml的RPMI 1640中

C.加入200μl溶解在RPMI 1640中的1mg / ml的6-CFDA溶液

D.在37°C孵育30分鐘。

E.用HEPESCaMg緩沖液洗滌細(xì)胞3次

F.調(diào)整細(xì)胞濃度至2×10 ^6個(gè)細(xì)胞/毫升。

6.加入100μl6 -CFDA負(fù)載的細(xì)胞（2×10 ^6個(gè)細(xì)胞/ ml）到含有100μlHEPESCaMg的包被孔中。

7.在室溫下孵育20分鐘。

8.將微量滴定板置于靜態(tài)細(xì)胞粘附的清洗室中，充滿HEPESCaMg緩沖液并密閉室以消除任何空氣界面和泄漏。

9.翻轉(zhuǎn)室，使未結(jié)合的細(xì)胞從孔中脫落6分鐘。在室溫下。

10.將清洗室放在一邊，取下墊片的頂部，用鑷子輕輕地以15度的角度取下蓋板，以確保液體保留在孔中。

11.使用微量滴定板閱讀器如Perseptive Biosystems，Inc。的Cytofluor 2350測(cè)量熒光