描述

HFc-NC-MMAF是抗人IgG Fc特異性抗體，通過不可裂解的連接子與一甲基auristatin F(MMAF)結(jié)合。抗體部分是人IgG Fc區(qū)的特異性多克隆抗體。單甲基澳瑞他汀F(MMAF)是一種細(xì)胞毒性小分子，通過阻斷微管蛋白的聚合來抑制細(xì)胞分裂。連接MMAF與抗體的不可裂解連接子在細(xì)胞外液中是穩(wěn)定的，但進(jìn)入細(xì)胞后可以通過非特定機(jī)制裂解。

申請方案

我們建議您對細(xì)胞進(jìn)行滴定，以確定基于細(xì)胞的活力檢測的數(shù)量。同樣重要的是確定2°ADC本身的濃度，而不會對每個細(xì)胞系造成顯著的細(xì)胞毒性（即小于10%的細(xì)胞死亡）。您可以選擇細(xì)胞毒性檢測的試驗方法。以下是使用CellTiter-Glo發(fā)光法作為檢測方法進(jìn)行細(xì)胞活力測定的兩個示例。

• 在細(xì)胞活力試驗中使用恒定量的HFc-NC-MMAF：
  1. 在培養(yǎng)基中將細(xì)胞新鮮分裂成不透明的多孔板。在96孔板中每孔加入100μl細(xì)胞。典型范圍是96孔板中每孔約5000至20000個細(xì)胞。然而，應(yīng)確定每個細(xì)胞系的細(xì)胞數(shù)量。
  2. 在培養(yǎng)基中稀釋含單克隆一抗(mAb)的人Fc。然后在培養(yǎng)基中對一級mAb進(jìn)行系列稀釋。
  3. 在每個孔中加入2 l稀釋的一級mAb。一級mAb的終濃度應(yīng)介于100 nM-0.01 nM（或15 ng/μl-1.5 pg/μl）之間。在抗體存在下孵育細(xì)胞5-10 min。
  4. 同時，在培養(yǎng)基中制備2°ADC HFc-NC-MMAF稀釋液。應(yīng)確定每種細(xì)胞系中每種特定mAb的HFc-NC-MMAF稀釋度。然而，檢測孔中HFc-NC-MMAF的推薦初始濃度為6.6 nM（或1 ng/l）。例如，在這種情況下，將2.9 l11.3 M（或1.7 g/l）HFc-NC-MMAF稀釋于97.1 l培養(yǎng)基中，然后在用一級mAb預(yù)孵育的96孔板中每孔加入2 l稀釋的HFc-NC-MMAF。
  5. 此外，每個測定板中還應(yīng)包括未用一級mAb或2°ADC處理的對照孔，以獲得正常細(xì)胞生長值。
  6. 根據(jù)培養(yǎng)方案孵育多壁平板72小時。
  7. 向96孔板的每個孔中加入100 lCellTiter-Glo試劑。
  8. 在定軌振蕩器上混合內(nèi)容物2 min，以誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。在室溫下孵育10 min。
  9. 讀取發(fā)光強(qiáng)度。