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動物細胞培養(yǎng)及外源基因的導(dǎo)入實驗
點擊次數(shù)：1430 發(fā)布時間：2016-12-5
細胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中應(yīng)用的技術(shù)之一。它的突出優(yōu)點，一是研究對象是活的細胞，可長時期地監(jiān)控、檢測甚至定量評估其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動等；二是可以人為地嚴格控制研究條件，便于研究各種物理、化學(xué)、生物等外界因素對細胞生長、發(fā)育和分化等的影響，有利于單因子分析；三是研究的樣本可以達到比較均一性。常用的細胞系均是性質(zhì)均一的細胞，需要時還可采用克隆化等方法使細胞進一步純化；四是研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄。體外培養(yǎng)的細胞可采用顯微鏡，電鏡等直接觀察記錄，充分滿足實驗的要求。另外還具有研究范圍比較廣泛，研究費用相對經(jīng)濟等優(yōu)點。
然而，細胞培養(yǎng)也有其局限性。由于培養(yǎng)的細胞脫離了機體復(fù)雜的環(huán)境條件，其細胞形態(tài)和功能都會發(fā)生一定程度的改變。尤其是體外反復(fù)傳代、長期培養(yǎng)的細胞，有可能發(fā)生染色體非二倍體改變等情況。因此，應(yīng)將體外培養(yǎng)的細胞視為一種既保持動物體內(nèi)原細胞一定的性狀又具有某些改變的特定的細胞群體。
由于細胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點是其他實驗方法和技術(shù)所不能比擬的，所以近年來細胞培養(yǎng)技術(shù)在分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、老年學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和病毒學(xué)等很多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，其中對于分子生物學(xué)家及細胞生物學(xué)家而言，應(yīng)用細胞培養(yǎng)對感興趣的基因產(chǎn)物進行定位、運動及功能研究變得越來越重要。在克隆一個基因后的下一步，往往是將其導(dǎo)入不同類型細胞，以分析其表達，測定表達對細胞生長的影響，或?qū)⒏弑磉_的基因產(chǎn)物純化。將外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細胞有兩種途徑：穩(wěn)定（*）或暫時性轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的是將轉(zhuǎn)移基因整合到細胞染色體DNA上，形成穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)移基因的細胞系。一般需要共轉(zhuǎn)染一個選擇標(biāo)記，用于追蹤轉(zhuǎn)染成功的細胞或轉(zhuǎn)染效率。暫時性轉(zhuǎn)染的目的是為了分析轉(zhuǎn)移基因的暫時轉(zhuǎn)錄或表達，一般在轉(zhuǎn)染后1-4天內(nèi)進行。針對培養(yǎng)細胞的外源DNA導(dǎo)入已發(fā)展出多種技術(shù)，其中常用的有磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔法等。這4種方法除DEAE-葡聚糖法外，均可用于暫時性轉(zhuǎn)染和*性轉(zhuǎn)染。但它們有各自適用的細胞系。培養(yǎng)的細胞不同，其在攝取和表達外源DNA的能力上可能存在幾個數(shù)量級的差異。因此針對細胞系優(yōu)化并比較幾種不同方法的效率很重要。
Graham和Vander EB（1973）報告了用Ca3(PO4)2-DNA沉淀將腺病毒SV40導(dǎo)入哺乳動物細胞的方法，Wigler等（1978）證明這種方法也能用于導(dǎo)入并在哺乳動物染色體上穩(wěn)定整合外源DNA。至今對于磷酸鈣介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染的確切機理仍不清楚。一般認為轉(zhuǎn)移DNA通過內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)，然后進入細胞核，而CaPO4處理被認為是產(chǎn)生了一種能促使DNA附著在細胞表面的環(huán)境。
細胞凋亡是細胞的一種基本生命現(xiàn)象，對于機體的組織發(fā)育、器官分化及多種病理過程均具有重要作用。細胞凋亡具有典型的形態(tài)學(xué)及生化特征。包括細胞膜皺縮，胞間連接減少，染色體凝集，細胞核崩解并形成凋亡小體等。其中一個強有力的生化指標(biāo)是“DNA Ladder”的產(chǎn)生，由于凋亡相關(guān)的特異核酸酶在凋亡過程中的激活，凋亡細胞的總DNA可以在核小體間進行切割，提取總DNA進行電泳可以形成間隔180-200bp的階梯狀電泳條帶（DNA Ladder）。一般認為出現(xiàn)DNA Ladder 的細胞肯定發(fā)生了凋亡，但并非所有發(fā)生凋亡的細胞都會出現(xiàn)DNA Ladder。這種檢測方法也受到靈敏性的限制，只有當(dāng)?shù)蛲黾毎嫉郊毎偭康?5%以上時，特異降解的DNA經(jīng)過電泳才會較好地顯示DNA Ladder。