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公司技術(shù)介紹Real-time PCR定量的四種方法
點擊次數(shù)：1543 發(fā)布時間：2012-12-24
實時熒光PCR定量包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類則是不利用雜交原理，而利用其他的一些理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。
1.TaqMan 探針
TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端， 而淬滅劑則在3’末端。當(dāng)探針與靶序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷， 使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此Taqman探針檢測的是積累熒光。常用的熒光基團(tuán)是FAM，TET，VIC，HEX。
2.分子信標(biāo)（molecular beacon）
分子信標(biāo)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。
分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30 個核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ);莖一般5-7 個核苷酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下，因為模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱變性會互補(bǔ)配對的莖環(huán)雙鏈解開，如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時，因淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。由于是酶切作用的存在，分子信標(biāo)也是積累熒光。常用的熒光基團(tuán)：FAM ，Texas Red 。
3.SYBR Green I
SYBR Green I 是一種能與雙鏈DNA 結(jié)合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈DNA結(jié)合后， 熒光大大增強(qiáng)。因此， SYBR Green I的熒光信號強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBR Green I 的zui大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長zui大約為520nm。
SYBR Green I 的缺點：由于SYBR Green I沒有特異性，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會結(jié)合發(fā)光，對PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光。所以在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。
SYBR Green I的優(yōu)點：SYBR Green I的優(yōu)點是因為其缺點產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合，所以對不同模板不需特別定制，通用性好，并且價格相對較低。這對科研是很有利的，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。
4. 熒光諧振能量傳遞（FRET）
FRET探針是羅氏的發(fā)明，又稱雙雜交探針，F(xiàn)RET探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針的5`端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，另一探針的3`端標(biāo)記Red 640熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時，探針結(jié)合在模板上，F(xiàn)AM基團(tuán)和Red640基團(tuán)相鄰，激發(fā)FAM產(chǎn)生的熒光，作為Red640基團(tuán)的激發(fā)光被吸收，使Red640發(fā)出波長為640的熒光。當(dāng)變性時，探針游離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能產(chǎn)生640波長的熒光。由于FRET探針是靠近發(fā)光，所以檢測信號是實時信號，非累積信號。常用的熒光基團(tuán)是：LC-Red640，LC-Red705。
5.LUX Primers
LUX （light upon extention） 引物是利用熒光標(biāo)記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術(shù)。目的使用類分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)設(shè)計引物，使引物同時起到熒光探針的作。引物對中的一個引物3’端用熒光報告基團(tuán)標(biāo)記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在模板存在的情況下，引物與模板配對，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生熒光信號。使用LUX引物，不需要專門設(shè)計探針，即省了成本又給實驗設(shè)計提供了寬松的條件。由于沒有探針控制特異性，因此他的特異性要弱于探針技術(shù)，但非特異性擴(kuò)增或引物二聚體沒有影響，所以其特異性要強(qiáng)于SYBR GREEN。
圖.LUX 引物工作原理
能用于實時熒光PCR定量的方法很多，各有特點。
| SYBR GREEN | FRET探針 | Taqman | 分子信標(biāo) | LUX 引物 | |
| 性質(zhì) | 可逆熒光 | 積累熒光 | |||
| 熔點分析 | 能 | 不能 | |||
| 特異性 | 引物（非特異性擴(kuò)增或引物二聚體有影響） | 引物＋2探針 | 引物＋探針 | 引物＋探針 | 引物（非特異性擴(kuò)增或引物二聚體無影響） |
| 探針 | 不需要 | 需要 | 需要 | 需要 | 不需要 |
| 通用性 | 通用 | ||||
這里僅列舉了熒光定量PCR定量的四種方法的原理，各自的特點。希望對大家有用。