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士鋒生物總蛋白和膜蛋白提取方法
點擊次數(shù)：1058 發(fā)布時間：2013-9-10
膜蛋白具有多種功能，在細(xì)胞識別、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、運輸?shù)扔兄兄匾慕巧虼艘彩堑乃幬锇悬c。抽提膜蛋白主要是進(jìn)行蛋白組分析：常用的實驗是非變性膠電泳、酶活分析、SDS-PAGE、western blot等。本文敘述了總蛋白的抽提方法、和膜蛋白的提取方法。
一、從新鮮樣品中提取總蛋白（簡易法）
1、自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，調(diào)pH值至8.5-9.0備用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制劑PMSF。該裂解液用量為10-50ml 裂解液/1g濕菌體。
2、將40ml 菌液在12000g，4℃下離心15分鐘收集菌體，沉淀用PBS懸浮洗滌2遍，沉淀加入1ml裂解液懸浮菌體。
3、超聲粉碎，采用300w，10s超聲/10s間隔，超聲20min，反復(fù)凍融超聲3次至菌液變清或者變色。
4、1000g離心去掉大碎片，上清可直接變性后PAGE電泳檢測，或者用1% SDS溶液透析后凍存。
缺點：Western blotting結(jié)果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。
二、從Trizol裂解液中分離總蛋白
1、Trizol溶解的樣品研磨破碎后，加氯仿分層，2-8℃下10000g離心15min，上層水相用于RNA提取，體積約為總體積的60%。
2、用乙醇沉淀中間層和有機相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3min，2-8℃不超過2000g離心5min。
3、將上清移至新的EP管中，用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1ml Trizol加入1.5ml異丙醇，室溫放置10min，2-8℃下12000g離心10min，棄上清。
4、用含有0.3M 鹽酸胍的95%乙醇洗滌。每1ml Trizol加入2ml洗液，室溫放置20min， 2-8℃下7500g離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌2次。zui后加入2ml無水乙醇，渦旋后室溫放置20min，2-8℃下7500g離心5min，棄上清。
5、冷凍干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反復(fù)吹打，50℃溫浴使其*溶解，2-8℃下10000g離心10min去除不溶物。
6、替代方案：將3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次，1000g離心10min去除沉淀，上清可直接用于蛋白實驗。
三、從新鮮樣品中提取疏水性膜蛋白（Triton X-114去污劑法）
1、配制疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，調(diào)pH值至8.0備用。
2、菌液于4℃條件下15000g離心15min收集菌體;用1ml 含有5mM MgCl2 的PBS洗滌3次，zui后于4℃條件下15000g離心15min收集菌體。
3、菌體沉淀加入1ml冷提取液，于4℃條件下放置2h，17000g離心10min，去除沉淀取上清。
4、將上述上清中的Triton X-114含量增加到2%，再加入20mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性，37℃條件下放置10min使其分層。室溫下1000g離心10min使液相和去污相充分分層。
5、將液相和去污相分開，分別用10倍體積的冷丙酮在冰上沉淀45min。
6、于4℃條件下17000g離心30min，用去離子水洗滌沉淀3次。
7、將沉淀溶解在1% SDS溶液中，測定蛋白濃度，比較液相和去污相中蛋白提取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白較多，適于進(jìn)一步蛋白實驗。
8、SDS-PAGE進(jìn)一步分析液相和去污相的蛋白圖譜。