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士鋒生物Ecoli原核表達(dá)的實(shí)驗(yàn)原理

最近更新時(shí)間：2013-9-9

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一、原理

1、E .coli 表達(dá)系統(tǒng)

E .coli 是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E .coli 菌株以后，通過溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-Page 以檢測表達(dá)蛋白質(zhì)。

2、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)

提高外源基因表達(dá)水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷。常用的有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。

不同的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)方法并不*相同，因啟動(dòng)子不同，誘導(dǎo)表達(dá)要根據(jù)具體情況而定。

二、材料

1、誘導(dǎo)表達(dá)材料

（1 ）LB （Luria—Bertani））培養(yǎng)基

酵母膏 （Yeast extract）5g 蛋白胨 （Peptone）10g

NaCl10g 瓊脂 （Agar）1-2%

蒸餾水 （Distilled water）1000ml pH 7.0

適用范圍：大腸桿菌

（2 ）IPTG 貯備液：2 g IPTG溶于10 ml 蒸餾水中，0 .22 μm 濾膜過濾除菌，分裝成1 ml /份，-20 ℃ 保存。

（3 ）l× 凝膠電泳加樣緩沖液：

50 mmol / L Tris -CI （pH 6 .8 ）

50 mmol / L DTT

2 % SDS （電泳級(jí)）

0.1 % 溴酚藍(lán)

10 % 甘油

2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料

1 ）酶溶法

（1）裂解緩沖液：

50 mmol / L Tris-CI （pH 8 .0 ）

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。

（3）10 mg / ml 溶菌酶。

（4）脫氧膽酸。

（5）1 mg / ml DNase I。

2 ）超聲破碎法

（1 ）TE 緩沖液。

（2 ）2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：

100 mmol / L Tris-HCI （pH 8 .0 ）

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 % 溴酚藍(lán)

20 % 甘油

三、實(shí)驗(yàn)方案

1、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)

（1 ）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。

（2 ）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌。

（3 ）篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒DNA 作限制性內(nèi)切核酸酶圖譜，DNA 序列測定，

確定無誤后進(jìn)行下一步。

（4 ）如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為PL 啟動(dòng)子，則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，使培養(yǎng)液的OD600達(dá)0.4-0.6 ，迅速使溫度升至42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ;如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為tac 等，則37 ℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h 。

（5 ）取上述培養(yǎng)液1 ml ,1000g 離心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS -PAGE 檢測。

2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化

1 ）細(xì)菌的裂解

常用方法有：① 高溫珠磨法;② 高壓勻漿;③ 超聲破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化學(xué)滲透等。前三種方法屬機(jī)械破碎法，并且方法① 、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用，后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實(shí)驗(yàn)步驟。

（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;殼多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要對(duì)細(xì)菌類有作用，而其他幾種酶對(duì)酵母作用顯著。主要步驟為：

① 4 ℃ ，5000rpm 離心，15 min ，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液（100 ml ）。棄上清，約每克濕菌加3 ml 裂解緩沖液，懸浮沉淀。

② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，攪拌20 min ;邊攪拌邊每克菌加4 mg 脫氧膽酸（在冷室中進(jìn)行）。

③ 37 ℃ ，玻棒攪拌，溶液變得粘稠時(shí)加每克菌20μL DNase I。室溫放置至溶液不再粘稠。

（2 ）超聲破碎法。聲頻為15-20 kHz 的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎，在處理少量樣品時(shí)操作簡便，液體量損失較少，同時(shí)還可對(duì)染色體DNA 進(jìn)行剪切，大大降低液體的粘稠度。

① 收集1 L 誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，40 ℃ ，5000r pm 離心，15 min ;棄上清，約每克濕菌加3 mlTE 緩沖液。

② 按超聲處理儀廠家提供的功能參數(shù)進(jìn)行破菌;10 000g 離心，15min ，分別收集上清液和沉淀。

③ 分別取少量上清和沉淀，加入等體積的2× 凝膠電泳加樣緩沖液，進(jìn)行SDS -PAGE 。

注意事項(xiàng)：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度、菌種類型等因素有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握;超聲波破菌前，標(biāo)本經(jīng)3 -4 次凍溶后更容易破碎。

2 ）包涵體的分離

蛋白質(zhì)在細(xì)菌中的高水平表達(dá)，常形成相差顯微鏡下可見到的細(xì)胞質(zhì)顆粒，即為包涵體，經(jīng)離心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA 或尿素洗滌，若為獲取可溶性的活性蛋白，須將洗滌過的包涵體重新溶解并進(jìn)行重折疊。

（1）試劑與配制

① 洗滌液I：

0.5 % Triton X -100

10 mmol / L EDTA （pH 8 .0 ）

溶于細(xì)胞裂解液中。

② 2×凝膠電泳加樣緩沖液。

（2）細(xì)胞裂解混合物12 000g 離心，15 min ,4 ℃ ;棄上清，沉淀用9× 洗滌液l 懸浮;室溫放置5 min ; 12 000g 離心15 min ,4 ℃ ;吸出上清，用100 μL 水重新懸浮沉淀;分別取10 μL上清和重新懸浮的沉淀，加10 μL 2× 凝膠電泳加樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE 。

3 ）包涵體的溶解和復(fù)性

（1）試劑與配制

① 緩沖液I：

1 mmol / L PMSF

8mol /L 尿素

10 mmol / L DTT

溶于前述裂解緩沖液中。

② 緩沖液Ⅱ：

50 mmol / L KH2PO4

1 mmol / L EDTA （pH 8 .0 ）

50 mmol / L NaCI

2 mmol / L 還原型谷胱甘肽

1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽

③ KOH 和HCI 。

④ 2×凝膠電泳加樣緩沖液。

（2）用100 μL 緩沖液I 溶解包涵體;室溫放置lh ;加9×緩沖液Ⅱ，室溫放置30 min ，用KOH 調(diào)pH 到10.7 ;用HCI 調(diào)至pH 8 .0 ，在室溫放置至少30 min ; 1000g 離心，15 min ，室溫;吸出上清液并保留，用100 μL 2×凝膠電泳加樣緩沖液溶解沉淀;取10 μL 上清，加10 μL 2× 凝膠電泳加樣緩沖液，與20 μL 重新溶解的沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 。

四、注意事項(xiàng)

（1）不同的大腸桿菌表達(dá)載體帶有不同的啟動(dòng)子和誘導(dǎo)成分。實(shí)驗(yàn)者必須根據(jù)特定系統(tǒng)和用途決定相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案。

（2）表達(dá)和檢測時(shí)，應(yīng)設(shè)置對(duì)照組，如轉(zhuǎn)化載體和非誘導(dǎo)細(xì)胞。

（3）由于大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)缺少哺乳動(dòng)物細(xì)胞特異的翻譯后加工，所以，其生物活性無法與天然蛋白質(zhì)相提并論。
 

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