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士鋒生物關(guān)于bsa標準曲線的制作方法討論
最近更新時間：2013-9-11
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14.3KB
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1、選擇應(yīng)用考馬斯亮藍方法測蛋白質(zhì)量，做BSA標準曲線步驟時已經(jīng)測得梯度蛋白量的吸光值。想求助：在excel中怎樣做標準曲線。
Q1、很簡單的，將蛋白質(zhì)濃度放在一列，相應(yīng)的吸光度放在一列，將兩列選中后，選擇插入圖形，選散點圖，然后在插入的圖形上的點右擊選擇添加趨勢線，并勾選顯示公式和R值，即可得到方程式。
Q2、用梯度蛋白量和吸光值先做出散點圖，然后點擊選中直線，在直線處點擊鼠標左鍵，出現(xiàn)“添加趨勢線”，點擊進入，在“類型”菜單中選擇“線性”，在“選項”菜單中選擇“顯示公式”“顯示R2值”，點擊“確定”，圖中即出現(xiàn)線性方程和R2，此方程即為標準曲線方程。
2、如何測BSA的標準曲線?配置BSA標準溶液時，需要濃度到小數(shù)點后四位嗎?
一般3個9以上就可以了，我們實驗室一般認為99.98%就足夠。
可以的，要注意幾點，一個是配置高濃度原液，而后在其基礎(chǔ)上稀釋；二是充分震蕩，每個步驟都要充分震蕩；三要選擇比較好的蛋白測定試劑盒，能用進口的就不要用國產(chǎn)的!
3、為什么BSA可以用來做標準曲線而不是選其他蛋白?
Q1、分子量68KD。BSA用的多主要是便宜，其他一些純蛋白是非常貴的，差價幾萬倍都是可能的。
4、BSA是否每次做標準曲線都要重配?
Q1、不用，你可以一批配100ml，然后分裝成小管凍存起來，以后每次用的時候取一只，這樣可以避免多次配置所產(chǎn)生的差異，使用也方便
Q2、書上寫一般情況下都是要做標曲的,但是不做的話差別也不是太大,但是要的話還是得做標曲.
5、我用考馬斯亮藍染色的方法作BSA標準曲線，怎么也做不出來!4mg/ml,5mg/ml,6mg/ml,7mg/ml,8mg/ml,10mg/ml的 bsa在595nm下的吸光值沒有明顯的區(qū)別，還出現(xiàn)濃度越大，吸光值越小的現(xiàn)象，真是令我哭笑不得，請高手指點，謝謝!
Q1、1,看看你的考馬斯亮藍是否配的有問題，注意配好后必須用慢速濾紙過濾，保證濾液中沒有藍色沉淀（會影響OD595）。
2，你的BSA濃度太高了，測定是OD595會很大。在測定光吸收時，測量值的準確度數(shù)范圍是：0.1-0.3。讀數(shù)大于0.5時就不準了。
3，BSA要現(xiàn)用現(xiàn)配，不可久放。
以下測量方法僅供參考：
取21支試管做三組平行（每組7支）：
向7支試管中依次加入：
（1）考馬斯亮藍各5ml；
（2）分別加入0.15mol的NaCl 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04ml；
（3）分別加入1.0mg/ml的新配的BSA 0, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06ml；
混勻后，在595nm處測光吸收，讀數(shù)大部分在0.1-0.3之間。
注意在加入BSA 5-20min內(nèi)測完，此時間內(nèi)顏色zui穩(wěn)定。
然后三組求平均，用蛋白含量對OD595作圖，線性擬合后，一般得到直線的R>0.99,嚴格要求應(yīng)使R>0.999.
在測量蛋白濃度時，可先將其稀釋為0.5-2mg/ml 左右，加入0.02-0.08ml；即可得到一個較好的讀數(shù)（一般在0.1-0.3之間）。
Q2、你的標準曲線范圍有問題,BSA濃度從0.1~1mg范圍內(nèi)選擇,那樣的濃度都是超出量程的,測了也沒用.還有,機器的量程是多少你沒說,吸光值在0.1~1范圍內(nèi)還是比較準確的,這還是進口設(shè)備,國產(chǎn)的量程有效范圍更窄.自己重新設(shè)計實驗吧