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士鋒生物聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE膠的制備過程
最近更新時(shí)間：2013-9-17
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>14.3KB
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聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于蛋白和寡核苷酸的分離，zui常用于蛋白質(zhì)的分離，這里總結(jié)了DNA電泳的各種濃度PAGE膠配制的配方及制備方法。
聚丙烯酰胺凝膠電泳簡(jiǎn)稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2（NHCOHC=CH2） 2 N,N'-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。
各種濃度page膠的配制（DNA電泳用）
50ml體系：
| 丙烯酰胺 | 有效分離（bp） | 二甲苯青 | 溴酚藍(lán) | 丙烯酰胺30%（ml） | 10×TBE（ml） | ddH2O（ml） | TEMED（µl） | 過硫酸銨10%（µl） |
| 3.5% | 100-1000 | 460 | 100 | 5.83 | 5 | 39.17 | 25.0 | 250 |
| 5.0% | 100-500 | 260 | 65 | 8.33 | 5 | 36.67 | 25.0 | 250 |
| 8.0% | 60-400 | 160 | 45 | 13.33 | 5 | 31.67 | 25.0 | 250 |
| 12.0% | 40-200 | 70 | 20 | 20.0 | 5 | 25.00 | 25.0 | 250 |
| 15.0% | 25-150 | 60 | 15 | 25.0 | 5 | 20.00 | 25.0 | 250 |
| 20.0% | 5-100 | 45 | 12 | 33.33 | 5 | 11.67 | 25.0 | 250 |
5ml體系：
| 丙烯酰胺 | 丙烯酰胺30% （ml） | 10×TBE （ml） | ddH2O （µl） | TEMED （µl） | 過硫酸銨10% （µl） |
| 3.5% | 0.583 | 0.5 | 3.917 | 2.5 | 25 |
| 5.0% | 0.833 | 0.5 | 3.667 | 2.5 | 25 |
| 8.0% | 1.333 | 0.5 | 3.167 | 2.5 | 25 |
| 12.0% | 2.00 | 0.5 | 2.5 | 2.5 | 25 |
| 15.0% | 2.50 | 0.5 | 2.0 | 2.5 | 25 |
| 20.0% | 3.333 | 0.5 | 1.167 | 2.5 | 25 |
1、丙烯酰胺30%為29：1（質(zhì)量比，丙烯酰胺：雙甲叉丙烯酰胺）
2、TEMED 可以加到1ul/ml。
不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍表
| 丙烯酰胺（%） | 有效分離范圍（bp） | 溴酚蘭* | 二甲苯青* |
| 3.5 | 100～2000 | 100 | 460 |
| 5.0 | 80～500 | 65 | 260 |
| 8.0 | 60～400 | 45 | 160 |
| 12.0 | 40～200 | 30 | 70 |
| 15.0 | 25～150 | 15 | 60 |
| 20.0 | 10～100 | 12 | 45 |
*表中給出的數(shù)字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對(duì)數(shù)目（bp）.
凝膠的制備過程：
1、 按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出。
2、 將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60℃角。
3、 按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù)。
4、 加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時(shí)為止。
5、 立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10°角，可減少液體泄漏的機(jī)會(huì)。
6、 室溫聚合一小時(shí)后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1XTBE緩沖液。
7、 小心取出梳子，加樣。
大家可以根據(jù)自己試驗(yàn)中DNA片段大小的不同選擇配制合適濃度的丙烯酰胺膠。PAGE膠配制過程中記得避免氣泡的產(chǎn)生。