聯(lián)系電話
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級會員·13年
- 聯(lián)系人：
- 曹女士
- 電話：
- 400-6111-883
- 手機：
- 售后：
- 4006-111-883
- 傳真：
- 86-21-34615995
- 地址：
- 上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號3樓
- 網(wǎng)址：
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機商鋪
【干貨】小磁珠，大用途，分選純化，一個不落
引文：
基因測序越來越得到臨床的認可，尤其是精準醫(yī)療概念提出以后，更是備受青睞，為精準治療解答很多未知的問題。高通量測序技術(shù)的跨越式發(fā)展，使測序能力大幅上升，整個NGS工作流程中，測序文庫的純化與篩選亦尤為重要。今天，我們就聊一聊核酸純化分選小能手——磁珠。
一、背景介紹
磁珠的發(fā)明構(gòu)想初來自于挪威科技大學(xué)的化學(xué)家John Ugelstad ，1976年他以聚苯乙烯為主要材料，制造出均勻磁化的球體粒子。1979年Vogelstein等報道在高濃度dian化鈉存在下玻璃粉末作為吸附劑用于從瓊脂糖凝膠中提取DNA///片段，而后基于硅膠和其他具有親水性表面的載體的固相核酸純化技術(shù)廣泛發(fā)展起來。
二、原理解讀
在整個體系中，影響DNA回收的因素包括聚乙二醇（PEG）、DNA大小和濃度、孵育時間等，其中PEG是影響DNA回收的決定性因素。DNA在較高濃度的PEG和NaCl中脫去分子水化層，分子構(gòu)象由線狀被壓縮成卷曲球狀，并暴露出大量帶負電荷的磷酸基團，帶負電荷的磷酸基團與羧基在Na+的作用下形成“電橋"，使DNA被特異吸附到磁珠表面。當PEG和NaCl被去除之后，加入水性分子，會快速充分水化DNA，解除三者間的離子作用，使得吸附到磁珠的DNA被純化出來。 此外，不同長度的DNA隨PEG分子量、濃度以及鹽濃度的不同，可以被選擇性的沉淀出來。
圖 磁珠純化原理示意圖
三、應(yīng)用
磁珠憑借其高通量，適用于自動化的特點在高通量測序中備受推崇，并廣泛用于NGS建庫中的產(chǎn)物純化/分選。
1. DNA純化
DNA純化的目的在于去除不想要的DNA///片段。由于磁珠優(yōu)先吸附大片段，因而可通過一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段，丟棄上清中的非目標片段，之后將磁珠吸附的目的DNA洗脫回收。常用于小片段如接頭二聚體/引物二聚體的去除。此外還有一些客戶會用于樣本的富集。
圖DNA純化操作示意圖
DNA樣本經(jīng)磁珠純化后會有部分樣本的損失，磁珠回收效率可評估磁珠的回收能力。通?？赏ㄟ^計算得出：回收效率=（純化后的DNA質(zhì)量/Input DNA質(zhì)量）×100%，如下表：
表 磁珠回收效率計算
測試人 | 樣本編號 | 投入量（ng） | 純化后總量（ng） | 回收率（%） | 平均回收效率（%） |
測試人1 （1.8×） | A | 169.5 | 153.25 | 90.41 | 90.41 |
B | 159.75 | 94.25 | 94.5 | ||
C | 162 | 95.58 | |||
D | 158.75 | 93.66 | |||
測試人2 （1.8×） | A | 169.5 | 154.5 | 91.15 | 91.15 |
B | 155 | 91.45 | 91.94 | ||
C | 154.25 | 91 | |||
D | 158.25 | 93.36 |
【注】：磁珠測試數(shù)據(jù)來源于上海某生物公司, 表格中A是B*磁珠，B、C、D分別是翊圣三個不同批次的磁珠。
2. DNA雙輪分選（片篩）
由于二代測序段短讀長的局限性，所以終的NGS文庫需滿足一定的長度要求。片篩的目的在于從片段化DNA中選擇特定區(qū)域的DNA///片段，以滿足上機需求。比如將樣本中的片段分布比作下圖中的正態(tài)分布，由于磁珠優(yōu)先吸附大片段，所以第—輪磁珠吸附目的片段以上的大片段，此時棄磁珠留上清（目的片段在上清中）。第二輪磁珠吸附目的片段，此時棄上清，再將磁珠上的目的片段洗脫回收。
圖DNA雙輪分選操作示意圖
分選精度則是評估不同的磁珠投入比例分選得到的片段大小。一般以Agilent 2100儀器檢測。
在特定磁珠比例（0.45×/0.15×）條件下，不同樣本分選后片段分布范圍集中在同一位置。較好的分選效果應(yīng)該是頂部窄而圓潤的獨峰。此外不同廠家由于buffer的不同在特定磁珠比例條件下分布也會有一定的差異，使用前需根據(jù)各廠家相應(yīng)的說明書確認目標片段的分選比例。
圖 不同樣本磁珠分選精度示意圖
四、明星產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品名稱：Hieff NGS® DNA Selection Beads（點這里）
產(chǎn)品特點：
*：采用進口原材料，品質(zhì)高度穩(wěn)定。
無縫替換：產(chǎn)品原理、產(chǎn)品操作和實驗結(jié)果與AMPure XP保持高度一致。
兼容性高：兼容目前市面上所有的DNA/RNA建庫試劑盒。
批次穩(wěn)定：嚴格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控，單次產(chǎn)能20L。
性能展示1：分選效果與XP高度一致：如下圖所示，相同的分選比例，翊圣磁珠與XP磁珠，分選效果相當。
圖 磁珠分選精度與XP對比示意圖
性能展示2：回收效果與XP高度一致：如下表所示，分別用0.8x和0.6x的回收比例對DNA marker和打斷的gDNA進行回收，翊圣3個批次的磁珠和XP磁珠回收效果相當。
【注】：磁珠測試數(shù)據(jù)來源于杭州某生物公司, 表格中分別是B*磁珠與翊圣三個不同批次的磁珠。
磁珠介紹到這里就結(jié)束了，希望以上總結(jié)可以幫助到正在努力實驗的你。
