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雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)~實驗操作篇
一
雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)原理
螢火蟲螢光素酶是一種胞內(nèi)蛋白，大小為61KDa。在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化底物螢火蟲螢光素氧化，生成氧化螢光素，并發(fā)出黃綠色光，其*發(fā)光波長為560nm。
二
雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)應(yīng)用
◆ microRNA研究
◆ 轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究
在報告基因的5'端加上待檢測基因的啟動子，就可以用來檢測轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用，啟動轉(zhuǎn)錄越多，那報告基因的表達(dá)量就越大，熒光值越高。
◆ 啟動子研究
將啟動子區(qū)域序列進(jìn)行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c(diǎn)進(jìn)行突變，再分別構(gòu)建到luciferase報告載體中，檢測其啟動子活性。
◆ 信號通路研究
信號通路的激活/監(jiān)測基因的表達(dá)水平。
......
三
雙螢光素酶報告基因檢測實驗操作流程
報告基因檢測流程主要有4個模塊：分別是質(zhì)粒構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、報告基因檢測和數(shù)據(jù)分析。
雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)一般將螢火蟲螢光素酶報告基因質(zhì)粒和海腎螢光素酶報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或?qū)⑦@兩個報告基因構(gòu)建到同一個骨架質(zhì)粒上（如pGL4質(zhì)粒），分別用不同的啟動子啟動其表達(dá)。
◆ 主報告基因載體的選擇
根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇對應(yīng)的載體骨架。
◆ 內(nèi)參報告基因載體的選擇
帶有表達(dá)組成型啟動子的螢光素酶表達(dá)載體作為內(nèi)參。
◆ 轉(zhuǎn)染細(xì)胞系選擇
◆ 轉(zhuǎn)染方法選擇
◆ 轉(zhuǎn)染報告基因比例
◆ 啟動子和轉(zhuǎn)錄因子比例
◆ 核酸與轉(zhuǎn)染試劑的比例
從1:2開始調(diào)整，另外，注意質(zhì)粒的純度、完整度和去內(nèi)毒素。
◆ 檢測試劑選擇
◆ 檢測板選擇
◆ 檢測儀器選擇
注：只選擇在最大波長處檢測發(fā)光，過濾掉其他發(fā)光信號，意味著檢測會丟掉很多信號，丟失靈敏度。
檢測時間：輝光型0.5-1 sec，閃光型2-10 sec。
通過儀器可以直接讀出螢火蟲和海腎螢光素酶的數(shù)值，兩種熒光值讀數(shù)不少于4位數(shù)，讀數(shù)大于8位數(shù)時，需要稀釋裂解上清（讀數(shù)與細(xì)胞種類、細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染方法、轉(zhuǎn)染時間等因素相關(guān)）。
歸一化值=螢火蟲螢光素酶讀值（主報告基因）/海腎螢光素酶讀值（內(nèi)參基因）
相對表達(dá)倍數(shù)=實驗組歸一化值/對照組歸一化值
給大家舉個例子：
分類 | F-Luc | R-Luc | 歸一化（F/R) | 平均值 | 相對表 達(dá)倍數(shù) |
對照組1 | 20118 | 50201 | 0.400748989 | 0.420043613 | 1 |
對照組2 | 18919 | 48091 | 0.393400012 | ||
對照組3 | 21910 | 47019 | 0.465981837 | ||
實驗組1 | 60129 | 60911 | 0.987161596 | 1.226184349 | 2.919183 |
實驗組2 | 87927 | 56873 | 1.546023596 | ||
實驗組3 | 78791 | 68791 | 1.145367853 |
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