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漲知識|qPCR專場八：細(xì)節(jié)-認(rèn)真的態(tài)度和科學(xué)的精神
RNA的完整性可通過Agilent 2100生物分析儀進(jìn)行分析，其在分析RNA完整性之后能夠給出準(zhǔn)確的數(shù)值（RIN值，全稱 RNA Intesity Number），該值在8-10之間表示RNA質(zhì)量非常好，小于7時表示RNA完整度較差。
實驗儀器的準(zhǔn)備
內(nèi)參基因的準(zhǔn)備
GAPDH不適合選作內(nèi)參的情況
GAPDH基因是糖酵解中的關(guān)鍵基因，在代謝過程中的表達(dá)很容易受到多種因素的影響。如在細(xì)胞的增殖過程中，細(xì)胞需要的能量ATP增多，糖酵解代謝加大，GAPDH基因的表達(dá)水平很有可能被上調(diào)。有報道稱，該基因可作為腫瘤發(fā)生的標(biāo)志物，在腫瘤組織與正常細(xì)胞及癌旁正常組織比較時，GAPDH表達(dá)并不一致。故在比較腫瘤組織與正常組織或細(xì)胞的某種基因或蛋白的表達(dá)時，GAPDH作為內(nèi)參應(yīng)慎重。
β-actin不適合選作內(nèi)參的情況
對于actin蛋白由幾種異構(gòu)體組成，actin大致可以分為6種，不同actin之間具有較大的序列相似性(>90%)。在肌肉組織中β-actin分布很少，心肌中主要是alpha-cardiac muscle actin蛋白。故并不是所有的組織都適合選β-actin作為內(nèi)參。例如當(dāng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化時，β-actin mRNA的表達(dá)水平增加；而假基因的存在也可干擾β-actin的檢測，此時并不適合選擇β-actin作為內(nèi)參。
18S rRNA不適合選作內(nèi)參的情況
rRNA的轉(zhuǎn)錄易受到各種生物因素和藥物的影響。在有絲分裂期間，28S、18S rRNA明顯減少或停止表達(dá)。此外存在很大爭議的是rRNA不包括poly(A)尾，在以oligo(dT)為引物的cDNA合成中不能被逆轉(zhuǎn)錄，建議在反轉(zhuǎn)錄的過程中除用oligo(dT)引物外，還要用18S作為反向引物，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA最好用RNA酶處理一下，再高溫滅活。
通過查詢研究相同或類似對象的文獻(xiàn)，獲取相關(guān)的內(nèi)參信息并測試； 查詢實時定量PCR內(nèi)參基因知識庫—ICG,獲取相關(guān)的內(nèi)參信息并測試； 選擇實驗室已經(jīng)常用的內(nèi)參，進(jìn)行預(yù)實驗測試。
加樣環(huán)境需保證
試劑準(zhǔn)備需注意
加樣過程需謹(jǐn)慎
加樣順序盡量選用先加大體積，后加小體積的方式；先加NTC，后加模板。加樣順序的把控可盡可能減少操作誤差和污染風(fēng)險。 槍頭勤更換，以減少交叉污染的風(fēng)險。在重復(fù)組和樣品類型之間需在每次吸取后更換槍頭。在加樣過程中，不要讓槍頭穿過其他孔或不同的樣品/檢測類型。 靈活使用移液槍，盡可能提升孔間重復(fù)和加樣精準(zhǔn)。針對10 μL及以下的小體積液體吸取，采用二檔吸取(按到底)，一檔排出(不按到底)。當(dāng)孔中有液體時，小體積液體加樣，需選用低吸附槍頭伸入至液面以下進(jìn)行排出，減少液體殘留在槍頭內(nèi)的現(xiàn)象。
密封、混合需全面
加樣至96孔板前后，切勿使用記號筆等在板的表面或者板底部寫字，這會干擾熒光激發(fā)和信號檢測。另外類似墨水等物質(zhì)可能會在qPCR儀器中從板上轉(zhuǎn)移至儀器模塊上，這類有色或熒光物質(zhì)污染模塊后會對當(dāng)前乃至后續(xù)的熒光定量PCR數(shù)據(jù)產(chǎn)生不利影響。用封板膜封板后，需檢查板的頂部以及驗證是否與板良好接觸，尤其是邊緣部分。 在正式上機(jī)前需對反應(yīng)組分充分離心混合，若混合不均勻，精準(zhǔn)度和效率可能會受到影響。另外需檢查孔中是否存在氣泡或黏附在孔壁上，若存在，需輕輕敲擊管子底部后短暫離心，從而消除溶液中的氣泡。
反應(yīng)體積是否填寫正確---需按照實際反應(yīng)體積來進(jìn)行填寫； 延伸環(huán)節(jié)熒光采集開關(guān)是否打開---若熒光采集開關(guān)未打開，則會發(fā)生無擴(kuò)增曲線的現(xiàn)象； 熔解曲線程序不同儀器各不相同，上圖中僅以Abi Q5為例，通常選用儀器默認(rèn)的信號采集程序即可。
方法 | 分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
動物組織/細(xì)胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
簡單植物總RNA提取，避開有毒試劑，最快40min完成 | MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒 | 19291ES | |
多糖多酚植物總RNA提取，最快30min完成 | MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 | 19292ES | |
細(xì)胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快8 min完成 | MolPure® Cell RNA Kit 培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒 | 19231ES | |
qPCR染料法 | 高靈敏通用型定量預(yù)混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES |
定量預(yù)混液 (染料法)，已發(fā)文章累計IF達(dá)到5000+ | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11201ES | |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11202ES | ||
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11203ES | ||
高靈敏型qPCR預(yù)混液（染料法） | Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11198ES | |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11199ES | ||
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11200ES | ||
miRNA加A法高特異性定量預(yù)混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（加A法） | 11171ES | |
miRNA莖環(huán)法高特異性定量預(yù)混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（莖環(huán)法） | 11170ES | |
高靈敏一步法反轉(zhuǎn)定量試劑盒(染料法) | Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit | 11143ES | |
細(xì)胞直擴(kuò)RT-qPCR，1.5 h從細(xì)胞到基因表達(dá)分析(染料法) | Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit | 11172ES | |
反轉(zhuǎn)錄試劑 | 5 min快速反轉(zhuǎn)，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-示蹤版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11149ES |
5 min快速反轉(zhuǎn)，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-常規(guī)版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye） | 11150ES | |
15 min一步完成gDNA去除與反轉(zhuǎn)錄(下游應(yīng)用qPCR) | Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR | 11142ES | |
鏈cDNA合成預(yù)混液，含gDNA去除(下游應(yīng)用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
最長可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) | 11139ES | |
常規(guī)30 min反轉(zhuǎn)預(yù)混液,含gDNA去除（下游應(yīng)用qPCR） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES | |
miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（加A法） | Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法） | 11148ES |
