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漲知識 | qPCR專場七：認識不同熒光定量PCR方法
熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實驗過程中，我們需要注意諸多細節(jié)，謹慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實驗，拿到實驗結(jié)果，發(fā)表高分文章，走上人生呢？
圖.PCR循環(huán)流程
染料法熒光定量PCR | 探針法熒光定量PCR | |
特異性 | 中 | 高 |
靈敏度 | 中 | 高 |
可重復(fù)性 | 中 | 高 |
多重反應(yīng) | - | 可多重 |
探針/引物設(shè)計 | 引物 | 探針+引物 |
實驗成本 | 低 | 高 |
應(yīng)用 | 特定基因表達差異分析；DNA定量 | 特定基因表達分析；DNA定量；SNPs基因分析；基因突變檢測；產(chǎn)前遺傳病檢測；傳染病早期病原體檢測 |
另外不同miRNA之間堿基序列的差異不大，在僅有的18-28個核苷酸內(nèi)，不同miRNA甚至?xí)霈F(xiàn)僅1個核苷酸不同的現(xiàn)象，高效特異性區(qū)分不同miRNA也十分重要。因此，常規(guī)的熒光定量可能難以滿足miRNA實驗?zāi)繕怂瑁枰x用專門針對短片段擴增，且能高特異性準確定量的熒光定量試劑。
多重?zé)晒鈾z測，可以通過單個PCR反應(yīng)中進行多個基因的擴增從而減少qPCR反應(yīng)所需要的樣品量，且該方式和單重?zé)晒舛繖z測一樣靈敏準確。除了節(jié)省樣本量外，還可節(jié)省試劑以及設(shè)置實驗程序和分析實驗結(jié)果所需要的時間。單孔擴增多個基因也可最大限度地減少移液誤差。
使用多重?zé)晒舛縋CR也有需要注意的事項，其中最為重要的是，需要保證不同基因在單重?zé)晒舛糠磻?yīng)中和多重?zé)晒舛糠磻?yīng)中的結(jié)果是一致的。尤其是擴增的基因中同時存在著低豐度表達基因和高豐度表達基因。
cDNA量充足：反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA可選擇通過稀釋或者直接使用的方式滿足多次實時熒光定量實驗；
滿足多靶標：通過oligo dT和隨機引物，可以從單個RNA樣本中擴增多個靶標。
便捷性差：兩步反應(yīng)需要更多的處理，不太適合高通量應(yīng)用；
污染風(fēng)險：由于每個步驟都需要使用單獨的管子，污染的風(fēng)險增加；
cDNA產(chǎn)物中殘留試劑的抑制：反轉(zhuǎn)錄酶和反轉(zhuǎn)錄緩沖液殘留會一定程度抑制熒光定量PCR，因此在熒光定量PCR中建議僅使用10%的cDNA進行反應(yīng)。若稀釋不當，相關(guān)殘留組分可能會抑制DNA聚合酶。
減少污染：一管一步式可防止在反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR階段之間引入污染物；
便捷：移液步驟減少，手動操作時間減少；
高通量檢測：每個樣本獲得結(jié)果的總時間縮短且可重現(xiàn)性高；
靈敏度高：所有產(chǎn)生的第一鏈cDNA都可用于實時PCR擴增，一定程度上提高靈敏度。
二聚體風(fēng)險增加：上下游基因特異性引物在42℃-50℃下更易發(fā)生二聚體聚合，從而導(dǎo)致非特異擴增；
檢測靶標數(shù)少：單一RNA模板能夠檢測的靶標數(shù)量相對較少。
方法 | 分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
動物組織/細胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
簡單植物總RNA提取，避開有毒試劑，最快40min完成 | MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒 | 19291ES | |
多糖多酚植物總RNA提取，最快30min完成 | MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 | 19292ES | |
細胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快8 min完成 | MolPure® Cell RNA Kit 培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒 | 19231ES | |
qPCR染料法 | 高靈敏通用型定量預(yù)混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES |
定量預(yù)混液 (染料法)，已發(fā)文章累計IF達到5000+ | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11201ES | |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11202ES | ||
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11203ES | ||
高靈敏型qPCR預(yù)混液（染料法） | Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11198ES | |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11199ES | ||
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11200ES | ||
miRNA加A法高特異性定量預(yù)混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（加A法） | 11171ES | |
miRNA莖環(huán)法高特異性定量預(yù)混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（莖環(huán)法） | 11170ES | |
高靈敏一步法反轉(zhuǎn)定量試劑盒(染料法) | Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit | 11143ES | |
細胞直擴RT-qPCR，1.5 h從細胞到基因表達分析(染料法) | Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit | 11172ES | |
反轉(zhuǎn)錄試劑 | 5 min快速反轉(zhuǎn)，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-示蹤版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11149ES |
5 min快速反轉(zhuǎn)，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-常規(guī)版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye） | 11150ES | |
15 min一步完成gDNA去除與反轉(zhuǎn)錄(下游應(yīng)用qPCR) | Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR | 11142ES | |
鏈cDNA合成預(yù)混液，含gDNA去除(下游應(yīng)用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
最長可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) | 11139ES | |
常規(guī)30 min反轉(zhuǎn)預(yù)混液,含gDNA去除（下游應(yīng)用qPCR） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES | |
miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（加A法） | Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法） | 11148ES |
