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DNA-蛋白質(zhì)互作研究解決方案（上）
研究DNA與蛋白質(zhì)互作時(shí)，通常需要有目標(biāo)DNA或者目標(biāo)蛋白質(zhì)。如果研究時(shí)，只有處理材料，需要找尋處理材料中影響材料表型變化的調(diào)控因子，可以進(jìn)行ATAC-seq實(shí)驗(yàn)。
圖.100-10w細(xì)胞投入量ATAC結(jié)果
細(xì)胞投入量從100個(gè)到10萬個(gè)，均能得到建庫結(jié)果，且結(jié)果的擬合度較高。
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
Hieff NGS® ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina® ATAC建庫試劑盒 | 12208ES12/48 | 12 T/ 48 T |
Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® Tn5測序接頭 | 12416ES24/96 | 48 T/ 192 T |
已知材料中研究蛋白質(zhì)，需要探究該目的蛋白質(zhì)靶向的DNA結(jié)合區(qū)域，可以使用ChIP-seq、CUT&Tag、DAP-seq、CUT&RUN進(jìn)行研究得到結(jié)合的DNA序列后，再利用EMSA、雙熒光素酶報(bào)告基因、酵母單雜交實(shí)驗(yàn)、DNase I足跡試驗(yàn)等。若是研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)共調(diào)控的區(qū)域，還需要進(jìn)行CoIP或者GST pull down實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
ChIP-seq、CUT&Tag、DAP-seq、CUT&RUN介紹
ChIP
ChIP是研究DNA與蛋白互作的傳統(tǒng)經(jīng)典方法，需要將樣本進(jìn)行甲醛交聯(lián)后再用超聲設(shè)備進(jìn)行片段化處理，之后利用特異性抗體進(jìn)行靶向富集，將富集得到的DNA進(jìn)行建庫測序分析即得到靶向蛋白質(zhì)互作的DNA信息。
CUT&Tag是研究DNA與蛋白互作的新型技術(shù)，利用轉(zhuǎn)座酶對抗體靶向區(qū)域進(jìn)行切割，將切割得到的DNA序列可以一步擴(kuò)增得到DNA文庫。相對于ChIP-seq實(shí)驗(yàn)，CUT&tag具有可重復(fù)性強(qiáng)、背景噪音低、起始量要求低等優(yōu)點(diǎn)。
Multi-CUT&Tag是利用新興的納米抗體偶聯(lián)Tn5（Nanobody-Tn5），利用納米抗體識別一抗，使得Tn5被納米抗體靶向到特定位置發(fā)揮靶向切割，將切割得到的DNA序列進(jìn)一步擴(kuò)增得到DNA文庫。相對于傳統(tǒng)CUT&Tag技術(shù)，Multi-CUT&Tag可以實(shí)現(xiàn)一份樣本，同時(shí)研究兩種靶標(biāo)，節(jié)約樣本和時(shí)間，實(shí)驗(yàn)無需二抗，減少實(shí)驗(yàn)流程。
CUT&RUN是研究DNA與蛋白質(zhì)互作的新型技術(shù)，利用Mnase酶對染色質(zhì)開放區(qū)域進(jìn)行切割，之后將切割得到的DNA進(jìn)行建庫以獲得靶向蛋白質(zhì)互作的DNA信息。
DAP-seq是研究DNA與蛋白互作的技術(shù)，它屬于體外ChIP-seq，主要針對一些非模式物種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因體系或者過表達(dá)實(shí)驗(yàn)不容易操作的樣本，本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是無需購買抗體即可實(shí)驗(yàn)。
CUT&Tag | Multi-CUT&Tag | ChIP-seq | CUT&RUN | DAP-seq |
胞內(nèi)反應(yīng) | 胞內(nèi)反應(yīng) | *胞內(nèi)反應(yīng) | 胞內(nèi)反應(yīng) | 胞外反應(yīng) |
收集細(xì)胞，無需特殊處理 | 收集細(xì)胞，無需特殊處理 | 甲醛交聯(lián) | 收集細(xì)胞，無需特殊處理 | 提取樣本DNA進(jìn)行片段化和接頭連接 |
ConA磁珠與細(xì)胞孵育 | ConA磁珠與細(xì)胞孵育 | 細(xì)胞破碎裂解，超聲打斷gDNA | ConA磁珠與細(xì)胞孵育 | |
一抗二抗結(jié)合目的蛋白 | 兩種抗體同時(shí)孵育并靶向（無需二抗） | 一抗結(jié)合目的蛋白 | 一抗二抗結(jié)合目的蛋白 | 麥胚乳蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白并在在體外與DNA進(jìn)行共孵育 |
轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體結(jié)合二抗，激活反應(yīng) | 轉(zhuǎn)座酶結(jié)合、激活反應(yīng) | 免疫沉淀 | MNase酶復(fù)合體結(jié)合二抗，激活反應(yīng) | |
磁珠回收DNA片段 | 磁珠回收DNA片段 | 洗脫，解交聯(lián)，獲得DNA片段 | 純化獲得DNA片段 | 洗脫并純化獲得DNA片段 |
一步法PCR擴(kuò)增文庫 | 一步法PCR擴(kuò)增文庫 | 多步反應(yīng)：修復(fù)加A，加接頭，PCR擴(kuò)增 | 多步反應(yīng)：修復(fù)加A，加接頭，PCR擴(kuò)增 | 多步反應(yīng)：修復(fù)加A，加接頭，PCR擴(kuò)增 |
產(chǎn)物純化，上機(jī)測序 | 產(chǎn)物純化，上機(jī)測序 | 產(chǎn)物純化，上機(jī)測序 | 產(chǎn)物純化，上機(jī)測序 | 產(chǎn)物純化，上機(jī)測序 |
總時(shí)長：7.5 hour | 總時(shí)長：6 hour | 總時(shí)長：3-5 Day | 總時(shí)長：1-2 Day | 總時(shí)長：1-2 Day |
圖.不同組蛋白修飾的CUT&Tag及Multi-CUT&Tag實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Multi-CUT&Tag可以實(shí)現(xiàn)一份樣本，兩種不同組蛋白修飾的研究。組蛋白修飾同時(shí)研究的數(shù)據(jù)拆分后的結(jié)果與常規(guī)單靶標(biāo)研究結(jié)果一致。
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® | 12598ES12/48 | 12 T/ 48 T |
Hieff NGS® Multi-CUT&Tag Library Prep Kit for Illumina®Multi-CUT&Tag試劑盒（Nanobody-Tn5款） | 12592ES12/48 | 12 T/ 48 T |
Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® Tn5測序接頭 | 12416ES24/96 | 48 T/ 192 T |
Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V2 | 12195ES24/96 | 24 T/ 96 T |
Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina® | 12413ES02 | 96×2T |
欲知后續(xù)內(nèi)容，請待下周揭曉……
