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單細(xì)胞技術(shù)哪家強(qiáng)，翌圣生物來幫忙。
單細(xì)胞技術(shù)介紹
單細(xì)胞測序技術(shù)，簡單來說，就是在單個(gè)細(xì)胞水平上，對基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀基因組水平進(jìn)行測序分析的技術(shù)。傳統(tǒng)的測序，是在多細(xì)胞基礎(chǔ)上進(jìn)行的，實(shí)際上得到的是一堆細(xì)胞中信號的均值，丟失了細(xì)胞異質(zhì)性（細(xì)胞之間的差異）的信息。而單細(xì)胞測序技術(shù)能夠檢出混雜樣品測序所無法得到的異質(zhì)性信息，從而很好的解決了這一問題。
單細(xì)胞技術(shù)類型
單細(xì)胞技術(shù)類型很多，有單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞基因組、單細(xì)胞表觀組（單細(xì)胞ATAC、單細(xì)胞CUT&Tag、單細(xì)胞甲基化、單細(xì)胞Hi-C等）、單細(xì)胞蛋白組、單細(xì)胞代謝組等，各種技術(shù)不斷迭代，檢測靈敏度也不斷提升。
在眾多細(xì)胞技術(shù)中，應(yīng)用廣泛的當(dāng)屬單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組了。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組也分為低通量的smart-seq1/2/3和高通量的微流控和微孔板等研究。
今天我們要介紹的主角是Smart-seq2
單細(xì)胞技術(shù)類型
Smart-seq技術(shù)于2012年由Ramsk?ld團(tuán)隊(duì)發(fā)表；
Smart-Seq2技術(shù)于2013年及2014年由Picelli團(tuán)隊(duì)改進(jìn)并發(fā)表；
Smart-seq3技術(shù)則于2020年由瑞典卡羅林斯卡學(xué)院的Rickard團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步改進(jìn)并發(fā)表。
雖然Smart-seq技術(shù)也迭代了多個(gè)版本，但是迄今為止，Smart-Seq2是使用最多且被廣泛認(rèn)為更穩(wěn)定的技術(shù)類型，也是國內(nèi)市場眾多科技服務(wù)公司推崇的技術(shù)之一。
Smart-seq2技術(shù)原理
Smart-seq2關(guān)鍵技術(shù)原理有：
MMLVRT
使用的MMLV具有鏈置換活性和末端轉(zhuǎn)移酶活性。其在逆轉(zhuǎn)錄到達(dá)mRNA 5’端末端時(shí)，會在新合成的cDNA的3’末端多出幾個(gè)C堿基；
TSO引物序列
TSO引物的5’端含有1個(gè)通用引物序列，而在其3’端，有兩個(gè)核糖鳥苷（rG）和一個(gè)鎖核苷酸（LNA）修飾的鳥苷（G），可以促進(jìn)模板轉(zhuǎn)換，進(jìn)而擴(kuò)增出完整的cDNA序列；
某些物種RNA中有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、環(huán)形結(jié)構(gòu)等二級結(jié)構(gòu)容易形成空間位阻影響逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，添加甜菜堿和海藻糖能在一定程度上增加酶的熱穩(wěn)定性，同時(shí)破壞RNA的空間位阻。同時(shí)，甜菜堿和Mg2+同時(shí)存在，能在一定程度上提高cDNA產(chǎn)量。
Smart-seq2技術(shù)流程
Smart-seq2單細(xì)胞分離方法
單細(xì)胞分離方法很多，有梯度稀釋法、口吸管移液法、自動(dòng)顯微操作法、顯微切割法、流式分選法等，不同的方法對比如下：
方法 | 描述 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
梯度稀釋法 | 梯度稀釋細(xì)胞懸液至每孔一個(gè)細(xì)胞 | 方法簡單，無需專業(yè)設(shè)備 | 耗時(shí)，分離得到的細(xì)胞可能是多個(gè)細(xì)胞 |
口吸管移液法 | 使用玻璃毛細(xì)管分離單細(xì)胞 | 方法簡單 | 操作困難，具有隨機(jī)行 |
自動(dòng)顯微操作法 | 使用自動(dòng)微量移液管分離單細(xì)胞 | 可在位置放置細(xì)胞 | 需要專業(yè)設(shè)備 |
激光顯微切割 | 使用激光從組織切片中分離單細(xì)胞 | 保留了空間關(guān)系 | 技術(shù)上有難度，有潛在UV損傷 |
FACS | 使用電荷分離含有單細(xì)胞的微滴 | 根據(jù)細(xì)胞大小、形態(tài)、內(nèi)部復(fù)雜性和蛋白表達(dá)（通過抗體標(biāo)記）準(zhǔn)確篩選細(xì)胞類型 | 需要昂貴的專業(yè)設(shè)備，細(xì)胞處于高壓條件下 |
Smart-seq2技術(shù)與其他單細(xì)胞技術(shù)對比
單細(xì)胞技術(shù)除了Smart-seq、Smart-seq2和Smart-seq3之外，還有CEL-seq2/C1、Drop-seq、MARS-seq、SCRBseq。文章Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Mol Cell. 2017;65(4):631-643.e4. doi:10.1016/j.molcel.2017.01.023從不同角度來對單細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行評估，綜合來看，Smart-seq2更勝。
測序質(zhì)量對比
圖.不同單細(xì)胞技術(shù)的測序質(zhì)量對比
六種測序方法都有比較好的測序質(zhì)量，均超過 50% 的數(shù)據(jù)成功被 mapping到。另外，可以明顯發(fā)現(xiàn)基于全長測序方案的 Smart-seq 較 UMI，外顯子區(qū)域的 reads 更多，其中 smart-seq2 有 48% 的 reads 比對到外顯子區(qū)域（如下圖）。這表明 Smart-seq2（48% reads 比對到外顯子）和 Smart-seq（30% reads 比對到外顯子）較 UMI 方案（均低于 15% reads 比對到外顯子）有更好的測序質(zhì)量。
基因檢測效率對比
圖.不同單細(xì)胞技術(shù)測序深度和基因檢出數(shù)對比
采用抽樣的飽和度分析對測序深度進(jìn)行評估，當(dāng)測序深度達(dá)到 100 萬reads時(shí)，這六種測序方法均可達(dá)到飽和，但明顯 Smart-seq2 具有更好的基因檢測效率。
單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)的敏感度對比
圖.不同單細(xì)胞技術(shù)基因檢出情況對比
在相同的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞建庫，相同的測序深度下，檢測單細(xì)胞中基因表達(dá)數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smart-seq2 敏感度最好，達(dá)到中位數(shù) 9138/cell，而低的是 Drop-seq 和 MARS-seq，分別約為 4811/cell 和 4763/cell。
多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)的敏感度對比
圖.不同數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行微量細(xì)胞建庫時(shí)基因檢出情況對比
多個(gè)細(xì)胞建庫后的reads合在一起進(jìn)行生信分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smart-seq2 仍然具有更多的基因被檢測到，MARS-seq 仍然具有最少的基因被檢測到，這與單細(xì)胞敏感度檢測是一致的。
單細(xì)胞建庫結(jié)果重復(fù)性對比
圖.不同單細(xì)胞技術(shù)建庫后的相關(guān)性分析
利用 92 個(gè)已知的外源 ERCC 轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步采用線性模型擬合了觀測的表達(dá)值與已知濃度的相關(guān)系數(shù)（R2）。通過分析發(fā)現(xiàn)，這六種方法的相關(guān)系數(shù)都較高，都高于 0.80 的相關(guān)系數(shù)。這表明這六種方法的準(zhǔn)確度都較好，但 Smart-seq2 的相關(guān)系數(shù)為 0.91，而 MARS-seq 相關(guān)系數(shù)為 0.83。
不同單細(xì)胞技術(shù)的Drop out對比
圖.不同單細(xì)胞技術(shù)Drop out結(jié)果對比
對至少 65 個(gè)單細(xì)胞分析中發(fā)現(xiàn)，13361 個(gè)基因在 25% 的細(xì)胞中至少被一種方法檢測到表達(dá)，那么挑選這些基因進(jìn)行分析，MARS-seq 具有最高的 drop out 中位概率（74%），而 Smart-seq2 （26%），此時(shí)說明 Smart-seq2 具有更好的敏感度，這與之前的敏感度也是對應(yīng)的。
看了以上結(jié)果，是不是對Smart-seq2技術(shù)更心動(dòng)了呢，如果你有需求，聯(lián)系翌圣獲取詳情吧！
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