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近年來，RNA研究在生物醫(yī)學領域引起了廣泛關注，并取得了突破性進展。非編碼RNA在基因表達調控中發(fā)揮著關鍵作用，它們通過與DNA或蛋白質相互作用，影響基因的轉錄、剪接和穩(wěn)定性，從而調控細胞的功能和命運。此外，RNA編輯也成為研究的熱點，通過改變mRNA分子中的核苷酸，我們可以改變蛋白質的序列和功能。這些進展為我們深入理解基因調控、疾病機制以及開發(fā)治療手段提供了重要的基礎。
RNA研究的進展，離不開工具酶的發(fā)現和改造。今天，我們要向大家介紹一種在RNA研究中至關重要的工具酶——T4 RNA Ligase 1。
T4 RNA Ligase 1簡介
T4 RNA Ligase 1是一種ATP依賴性的酶，能催化單鏈RNA、單鏈DNA或單核苷酸之間形成磷酸二酯鍵的連接反應。它對于RNA分子間的連接尤為高效，其次便是DNA與RNA之間的連接，而在連接DNA分子時效率相對較低。因此，T4 RNA Ligase 1也被稱為“單鏈RNA連接酶"。在應用方面，T4 RNA Ligase 1廣泛應用于多個分子生物學領域，包括microRNA (miRNA)檢測、RNA文庫構建、環(huán)狀重測序（CirSeq）、向導RNA（gRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）合成等實驗中。
圖1. T4 RNA Ligase 1連接類型示意圖
T4 RNA Ligase 1應用
miRNA檢測
miRNA檢測在深入理解基因調控機制、發(fā)現疾病相關標志物、指導早期診斷、預后評估和制定治療策略等方面具有關鍵作用。然而，由于miRNA的長度一般只有20-30 nt，與標準PCR引物長度相近，這給檢測帶來了一定的困難。
為了解決這個問題，科學家們巧妙地利用T4 RNA Ligase 1將miRNA首尾相連成為circRNA，并結合RT-qPCR技術，研發(fā)出了一種名為miR-ID的新型檢測方法。miR-ID技術有效地解決了傳統(tǒng)RT-qPCR方法在miRNA檢測時復雜的莖環(huán)逆轉錄引物設計問題，同時，其滾環(huán)逆轉錄過程能夠生成含有大量重復目標序列的cDNA，這使得miRNA和其他小RNA分子的檢測變得極為靈敏。這一創(chuàng)新為miRNA檢測提供了一種更為可靠和有效的工具，進一步推動了miRNA研究和臨床應用的發(fā)展。
miR-ID包括以下步驟：
miRNA的環(huán)化
使用T4 RNA ligase 1使miRNA分子內的5’磷酸基團與3‘羥基首尾相連成為circRNA；
circRNA的逆轉錄
通過逆轉錄酶將circRNA轉換為包含大量miRNA重復序列的多聚cDNA；
qPCR擴增
使用5'端重疊引物和非特異性染料（如SYBR Green）對多聚cDNA片段進行PCR擴增。當miRNA存在時，RT-qPCR結果為陽性，當miRNA不存在時，RT-qPCR結果為陰性。
圖2. T4 RNA Ligase 1應用于miR-ID流程圖[1]
RNA文庫構建
構建RNA測序文庫是一個復雜的多步驟過程，涉及RNA的富集、片段化、逆轉錄成cDNA、接頭連接以及PCR擴增等關鍵步驟。傳統(tǒng)方法中，這流-程不僅繁瑣，還要求進行三次樣品純化，增加了實驗的時間和成本。此外，使用隨機引物進行cDNA合成可能會引入偏差，導致反轉錄效率不均一，從而影響測序結果的準確性。
T4 RNA Ligase 1的引入為簡化建庫流程帶來了突破。它允許直接在斷裂的RNA分子上連接接頭，繞過了隨機引物的使用，從而避免了由反轉錄不平衡引起的擴增偏差。通過采用T4 RNA Ligase 1，測序文庫構建的質量得以提升，而且純化步驟從三步縮減至兩步，顯著節(jié)約了純化試劑和時間，并減少了實驗操作的復雜性與勞動成本，使得整個建庫流程更為高效和經濟。
圖3. T4 RNA Ligase 1應用于RNA建庫流程圖[2]
CirSeq
在解讀NGS數據時，如何準確區(qū)分真正的基因變異和測序錯誤是一個具有挑戰(zhàn)性的問題。這些錯誤可能源自兩個主要方面：NGS測序過程中的誤差以及文庫制備階段的錯誤。CirSeq是一種高效且高精度的RNA病毒群體二代測序技術。它利用T4 RNA Ligase 1將病毒RNA片段環(huán)化并轉化為串聯重復的cDNA序列。在測序過程中，對每個讀段中的冗余拷貝進行比對，從而得到與初始RNA模板一致的序列。這種方法產生的測序數據錯誤率遠低于RNA病毒變異頻率，有助于超罕見變異的檢出和低頻變異的準確測量。
圖4. T4 RNA Ligase 1應用于CirSeq流程圖[3]
gRNA合成
CRISPR/Cas系統(tǒng)，一種廣泛使用的基因組編輯技術，它由Cas蛋白和人工重組的gRNA組成。這種系統(tǒng)能夠精確指導Cas蛋白對目標基因進行敲除、插入和突變修飾。目前，我們主要采用體外轉錄和化學合成的方法來制備gRNA。化學合成法憑借其編輯效率高、細胞毒性低以及穩(wěn)定性好等優(yōu)點，在實際應用中得到了廣泛的認可。然而，這種方法也存在一些局限性，如合成長度的限制以及副產物難以 去除等問題。為了克服這些困難，研究者們已經嘗試使用RNA連接酶將多個合成的RNA連接在一起，通過這種方式，提高gRNA的純度、產量和完整性，從而有效提高編輯效率并減少非特異性編輯的發(fā)生。
圖5. T4 RNA Ligase 1應用于gRNA合成示例
circRNA合成
線性RNA在生物學研究和治療中具有廣泛的應用，然而其較短的半衰期限制了其在長期蛋白質翻譯方面的應用。與此不同，circRNA是一種閉合環(huán)狀結構的RNA，廣泛存在于各種生物體中，具有更高的穩(wěn)定性和非帽依賴蛋白質翻譯的特點。因此，circRNA疫苗被認為是新一代RNA疫苗及藥物的潛在選擇，具備更簡單、穩(wěn)定性更好和持久性更長的優(yōu)勢。目前，合成circRNA的方法主要包括酶促連接合成和化學合成兩種。其中，酶促連接合成通過體外轉錄反應實現，利用DNA模板、T7 RNA聚合酶和RNA連接酶(如T4 RNA Ligase 1)等進行。酶促連接合成能夠以較低成本實現更長的circRNA合成，因此在目前被廣泛應用。
圖6. T4 RNA Ligase 1環(huán)化機理
T4 RNA Ligase 1作為一種多功能酶，在RNA研究中發(fā)揮著至關重要的作用，其應用不僅限于上述領域。翌圣生物專注于RNA研究領域，提供與RNA研究相關的工具酶原料，為RNA研究技術的應用和發(fā)展提供支持。
產品推薦
產品定位 | 產品名稱 | 貨號 |
RNA環(huán)化 | T4 RNA Ligase 1 | 14651ES |
RNA純化 | RNase R (20 U/μL) | 14606ES |
質粒線性化 | BspQI GMP-grade（10 U/μL） | 10664ES |
Bsa I GMP-grade | 10661ES | |
模板去除 | DNase I GMP-grade | 10611ES |
體外轉錄 | T7 RNA Polymerase GMP-grade (50 U/μL) | 10624ES |
Pyrophosphatase,Inorganic GMP-grade | 10620ES | |
Murine RNase inhibitor GMP-grade | 10621ES | |
mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade | 10614ES | |
mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase GMP-grade | 10612ES |
參考文獻：
[1] Kumar P, Johnston B H, Kazakov S A. miR-ID: a novel, circularization-based platform for detection of microRNAs[J]. Rna, 2011, 17(2): 365-380.
[2] Fuchs R T, Sun Z, Zhuang F, et al. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure[J]. PloS one, 2015, 10(5): e0126049.
[3] Acevedo A, Andino R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nat Protoc. 2014;9(7):1760-1769. doi:10.1038/nprot.2014.118.
