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隨著分子檢測的不斷發(fā)展，甲基化qPCR檢測以及甲基化NGS檢測已成為非常普及的檢測技術，這兩種技術的必經之路就是甲基化轉化，甲基化轉化從方法學上可分為亞硫酸氫鹽轉化和酶法轉化，近幾年，基于DNA甲基化位點的檢測試劑盒陸續(xù)獲批面世。NMPA批準的甲基化檢測試劑盒大部分為熒光PCR法，主要原因在于熒光PCR法操作簡便，無需在PCR后電泳，且具有靈敏度高、特異性強、重復性好等特點。這些甲基化檢測試劑采用的轉化方法為亞硫酸氫鹽轉化法，亞硫酸氫鹽轉化成為DNA甲基化檢測的“金標準"。但是傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽轉化有很多局限性，例如過長的轉化時間、嚴重的DNA損傷、被高估的5mC水平、C-U轉化不全等。
圖1.亞硫酸氫鹽催化C轉化為U的化學反應概要
2024年1月2日，芝加哥大學何川教授團隊在Nature Biotechnology上在線發(fā)表了題為Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5?methylcytosine in DNA and RNA的研究論文，該研究提出并開發(fā)了對DNA和RNA上的5-甲基胞嘧啶修飾進行快速，準確檢測的測序方法，簡稱為UBS-seq。該技術比現有的轉化反應過程加速20-30倍，同時明顯的降低了DNA損傷，以及C-U轉化導致的背景干擾。
圖2.UBS-seq法在微量樣本中應用，傳統(tǒng)BS轉化相比有更低的背景噪音
翌圣生物的Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit（柱式：12225ES）和Hieff® Mag Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit（磁珠法：12227ES）便是基于此技術開發(fā)優(yōu)化而成，可以在98°C 5min條件下可完成＞99.5%的胞嘧啶轉化，并且極大的降低了DNA損傷，更好的保證了DNA片段的完整性，約35 min可完成BS轉化全流程，轉化后的產物適用于PCR擴增和DNA測序等下游應用。
實驗流程
圖3.Superfast BS轉化實驗流程
投入不同量的293gDNA，293gDNA參入0.5% λ DNA，使用12227（磁珠法）與競品1轉化試劑盒進行頭對頭對比，同時采用雙鏈甲基化DNA建庫（12214ES），如圖4所示：12227（磁珠法）對不同投入量的DNA中 λ DNA C的轉化率≥99.5%，轉化時間適當延長，能進一步提高轉化效率。
圖4.12227和競品的轉化率
10 ng cf DNA和50 ng FFPE DNA，cf DNA和FFPE DNA都參入0.5% λ DNA，使用12227（磁珠法）與競品1轉化試劑盒進行頭對頭對比，同時采用雙鏈甲基化DNA建庫（12214ES），如圖5所示：12227（磁珠法）對不同樣本中 λ DNA C的轉化率≥99.5%，轉化時間適當延長，能進一步提高轉化效率。
投入不同量的293 DNA，使用12225和12227與競品1轉化試劑盒進行頭對頭對比，轉化后采用Qubit ssDNA定量，計算回收率，如圖6所示：12225的樣本回收率能穩(wěn)定達到60%以上，并且當樣本量大于200 ng，回收率能超過70%，磁珠法轉化試劑在高投入量下，回收率略低于柱式法，1 μg以內，磁珠法的回收率能達到60%。
備注：競品1為磁珠法
在微流控的自動化單細胞DNA甲基化平臺上，進行單細胞甲基化轉化實驗，樣本中單細胞DNA轉化率在99%左右。
產品推薦
產品名稱 | 產品貨號 |
Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit超快速DNA亞硫酸氫鹽轉化試劑盒（柱式） | 12225ES |
Hieff® Mag Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit超快速DNA亞硫酸氫鹽轉化試劑盒（磁珠法） | 12227ES |
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