Zymolyase-20T（酵母裂解酶-20T）是通過Arthrobacter luteus（藤黃節(jié)桿菌）深層培養(yǎng)獲得的酶制劑，它能有效的裂解活酵母細胞細胞壁。該制劑是利用硫酸銨對培養(yǎng)液的鹽析作用獲得的凍干粉，其酶活單位是20,000 單位/g.其中主要負責裂解活酵母細胞的酶成分是?-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶，通過對?-1,3-葡聚糖連接位水解葡萄糖聚合物，釋放產(chǎn)物主要是昆布五糖。
簡述：
Zymolyase-20T（酵母裂解酶-20T）是通過Arthrobacter luteus（藤黃節(jié)桿菌）深層培養(yǎng)獲得的酶制劑，它能有效的裂解活酵母細胞細胞壁。該制劑是利用硫酸銨對培養(yǎng)液的鹽析作用獲得的凍干粉，其酶活單位是20,000 單位/g.其中主要負責裂解活酵母細胞的酶成分是ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶，通過對ß-1,3-葡聚糖連接位水解葡萄糖聚合物，釋放產(chǎn)物主要是昆布五糖。
產(chǎn)品說明：
單位定義：800nm條件下菌液吸光度下降30%，表示一個活力單位。
特異性：此產(chǎn)品的裂解譜包括以下屬的微生物：Ashbya, Candida, Debaryomyces, Eremothecium, Endomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kloekera, Kluyveromyces, Lipomyces, Metschikowia, Pichia, Pullularia, Torulopsis, Saccharomyces, Saccharomcopsis, Saccharomycodes, Schwannimomyces and others.
用途：可用于細胞裂解、原生質(zhì)球形成及葡聚糖水解。
說明：酵母細胞的裂解程度隨酵母菌的種類、生長階段及培養(yǎng)條件而改變。
聲明: Zymolyase是麒麟麥酒股份有限公司（Kirin Brewery Co., Ltd）的注冊商標。 儲存：凍干狀態(tài)于2-8°C中保存，若30°C下放置3個月約失去70%活力。
活力：20,000單位/g
其他酶:：ß-1,3-葡聚糖酶，約1.5 x 106單位 /g
蛋白酶，約1.0 x 104單位 /g
甘露聚糖酶, 約1.0 x 106單位 /g
淀粉酶，木聚糖酶，磷酸酯酶，微量DNase及Rnase（未檢出）
催化劑：二硫蘇糖醇（DTT）, ß-巰基乙醇及其他的巰基化合物（如半胱氨酸）
zui適pH及溫度：
pH 6.5, 45°C水解酵母葡聚糖
pH范圍：pH 5-10間保持穩(wěn)定
熱穩(wěn)定性：60°C，5min喪失細胞溶解能力
警告：使用非硝酸纖維濾器過濾除菌
原生質(zhì)球制備程序：
1. 室溫條件，5000rpm（3000 xg），5min離心酵母培養(yǎng)物；
2. 收集離心沉淀物（酵母細胞）并記錄濕重；
3. 用TE緩沖液懸浮細胞，加入量為1.4ml/g濕重細胞；（TE緩沖液配方：100 mM Tris [MP 8196231]，pH 8.0，100 mM EDTA [MP195173]）
4. 雙蒸水快速定容，終體積量為3.5ml/g濕重細胞； 5. 按照17.5 ul （總體積的1/200）/ g濕重細胞的量加入ß -巰基乙醇（MP 806445），目的是為了除去細胞外層中的甘露聚糖層； 6. 30°C輕搖溫育混合液，處于對數(shù)期生長的培養(yǎng)物處理15min，處于穩(wěn)定期生長的培養(yǎng)物處理45min；
8. 用S緩沖液重新懸浮細胞，加入量為4.0ml/g濕重細胞；（S緩沖液配方：1.0 M 山梨糖[MP 102938]，10 mM PIPES （MP 190257）, pH 6.5） 10. 再次用S緩沖液（4.0ml/g濕重細胞）懸浮細胞，另外加入Zymolyases（50U /g濕重細胞）；如果Zymolyases配制成附錄所示的溶液，則添加250ul即可。根據(jù)實驗情況zui先優(yōu)化酶使用量。 11. 30°C輕搖溫育混合液30min，根據(jù)以下方式監(jiān)測原生質(zhì)球形成程度：
（1）加1ul樣品到20ul S 緩沖液內(nèi)，原生質(zhì)球應(yīng)該保持完整；
（2）加1ul樣品到20ul雙蒸水中，原生質(zhì)球應(yīng)該破裂；顯微鏡下觀察比較兩個樣品的形態(tài)差異。
12．一般情況下反應(yīng)45-60min，原生質(zhì)球的形成量>90%，此時4oC下離心收集細胞，5000rpm，5min；
13. 再次用S緩沖液（2 ml/g濕重細胞）懸浮原生質(zhì)球，5000rpm離心5min；重復此步驟做第二次清洗；；
14.原生質(zhì)球離心沉淀物-70oC凍存。
溫和的裂解原生質(zhì)球方法如下; 用3倍體積的18%Ficoll（MP 160003）溶液懸浮細胞離心沉淀物，Ficoll溶解于含有0.5 mM CaCl2 （MP 195088）的10 mM PIPES 緩沖液內(nèi)，pH 6.5。
酵母菌基因組DNA的制備：
以下步驟快捷，適合于從少量酵母培養(yǎng)物中制備基因組DNA ：
1. 將過夜培養(yǎng)的10ml酵母菌培養(yǎng)物離心收集細胞，加入280ul TE Buffer（配方見原生質(zhì)球制備程序中的步驟3），300 ul雙蒸水，3 ul ß -巰基乙醇（MP 806445）；
2. 30oC溫育45min；
4. 用500 ul含有1 mg/ml Zymolyase 20T（MP 32-092-1）的S緩沖液懸浮細胞沉淀物（或者使用自己認為zui合適的酶濃度）； 6. 重復步驟3；
7. 用200 ul含有0.1%SDS（MP 190522）和2ug蛋白酶K （MP 809252）的TE 緩沖液懸浮細胞沉淀物；
8. 37oC溫育3小時，不時的混勻溶液；
9. 調(diào)水浴鍋的溫度至65oC，并溫育20min； 10. 從水浴鍋內(nèi)取出并冷卻至室溫；
11. 用200ul 1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液萃取，漩渦混勻并離心；從離心機內(nèi)取出并保留上清液；
12. 用200ul氯仿萃取上清液，之后重復漩渦混勻及離心；
13. 加入500ul95%乙醇到上清液內(nèi)，20oC沉淀10min；
14. 4oC下，15,000 xg離心20 min；
15. 自然風干或者于真空離心蒸發(fā)濃縮器內(nèi)晾干除去多余的乙醇，并加入200ul TE緩沖液（含有150 mM NaCl和1 ug核糖核酸酶A （MP 101076））溶解DNA;
16. 37oC溫育1小時；
17. 重復步驟11和12；
18. 加入2.5倍體積的95%乙醇，20oC沉淀10min； 19. 30ul雙蒸水重懸DNA。對1:500的DNA稀釋液測量A260，根據(jù)消光系數(shù)計算DNA產(chǎn)量；
20. 產(chǎn)量大約為40-50ug。
附錄:
以下配制的溶液適用于該產(chǎn)品的實驗程序中（但并不排除其他類型的母液也適用）
配制10 mg/ml（200U/ml）的母液，將凍干粉溶于已高壓滅菌的S緩沖液（配方見原生質(zhì)球制備程序中的步驟8）。 如果不被微生物污染，于4 oC下，此母液能2個星期以上時間內(nèi)保持高效；
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