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細胞培養(yǎng)中檢測支原體的常用方法
閱讀：2523發(fā)布時間：2021-4-6
支原體是1898年Nocard等發(fā)現(xiàn)的一種類似細菌但不具有細胞壁的原核微生物，能在無生命的人工培養(yǎng)基上生長繁殖，直徑50-300nm，能通過細菌濾器。支原體在過去曾稱之為類胸膜肺炎微生物（pleuropneumonia-like organism，PPLO），1967年正式命名為支原體。
支原體（mycoplasma）：又稱霉形體，為目前發(fā)現(xiàn)的原核生物，基因數(shù)量為480。支原體細胞中可見的細胞器是核糖體（支原體是原核細胞，原核細胞的細胞器只有核糖體）。支原體結(jié)構(gòu)也比較簡單，多數(shù)呈球形，沒有細胞壁，只有三層結(jié)構(gòu)的細胞膜，故具有較大的可變性。
支原體這種微小的微生物，是細胞培養(yǎng)中令人頭疼的大問題。支原體污染可能來自培養(yǎng)基、血清或?qū)嶒灢僮髡?，會影響細胞生長率、細胞形態(tài)、基因表達、細胞代謝和細胞活力。支原體感染不易察覺，因此對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測就非常重要。
污染實驗室培養(yǎng)細胞的支原體主要有八種，但還沒有哪種檢測方法能夠單槍匹馬把這八種支原體都檢測出來。支原體非常頑強，通常用于細胞培養(yǎng)的絕大多數(shù)抗生素都對其無效。例如青霉素主要作用于細菌細胞壁，但支原體沒有細胞壁因此就不受影響。無懈可擊的細胞培養(yǎng)技術(shù)始終是預(yù)防支原體感染的方式，另外及時找出受到支原體感染的培養(yǎng)物也很重要，這樣才能在感染擴散前快速采取有效措施。下面就為大家介紹幾種在培養(yǎng)細胞中檢測支原體的方法。
分離培養(yǎng)法
分離培養(yǎng)法是支原體檢測的金標(biāo)方法，其檢測度高。這種方法是從可疑的細胞培養(yǎng)體系中取樣，并接種到支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會在這種瓊脂平板上*生長，形成明顯可見的特征性菌落。分離培養(yǎng)法基本不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此被譽為支原體檢測金標(biāo)準(zhǔn)。不過分離培養(yǎng)法也存在兩個弊端，一是檢測時間太長，支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間。二是盡管可以檢測絕大多數(shù)支原體種類，分離培養(yǎng)法也有力所不及的時候，例如支原體M. hyorhinis。
DNA檢測法
DNA檢測需要將可疑樣品與指示細胞共同培養(yǎng)，因此一般需要幾天時間。DNA檢測所用的指示細胞通常是細胞質(zhì)區(qū)域較大的Vero細胞，如果原樣本中含有支原體，那么當(dāng)細胞DNA被熒光染料（如Hoechst染料）染色時，就可以在指示細胞的核周圍觀察到熒光斑點或熒光顆粒。分離培養(yǎng)法用來檢測支原體M. hyorhinis菌株并不可靠，而DNA法可以準(zhǔn)確的將其檢測出來。
PCR法
PCR法也可以檢測M. hyorhinis菌株，PCR法檢測支原體只需幾個小時，是但也是的支原體檢測方法。該方法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本，其中PCR引物通常針對支原體的16S rRNA基因。在凝膠電泳過程中，支原體DNA會顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。PCR法可以檢測大多數(shù)支原體，但謹(jǐn)慎起見同時使用另一種檢測方法來進行驗證。
酶學(xué)檢測和ELISA
此外，也還存在一些其他支原體檢測方法。例如酶學(xué)檢測是將可疑樣本添加到特定底物中，在這一體系內(nèi)支原體的酶可以將ADP轉(zhuǎn)化為ATP，隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。ELISA也能用于支原體檢測，以ELISA法為基礎(chǔ)的支原體檢測一般使用針對支原體16S rRNA基因的帶標(biāo)記探針或抗體，來檢測培養(yǎng)物中是否含有支原體。
定期檢測法
支原體感染會使培養(yǎng)細胞慢慢枯萎，因此對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應(yīng)該進行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規(guī)化堅持下去，是細胞培養(yǎng)實驗室應(yīng)對支原體感染的關(guān)鍵。
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