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甲基化特異性PCR

閱讀:2655      發(fā)布時間:2018-7-19
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甲基化特異性PCR

標簽: 甲基化 特異性 PCR

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾,它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體,將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶(mC)的一種反應(yīng),在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯yi存在的化學性修飾堿基。

  • 亞硫酸氫鈉法
實驗方法原理MSP是一種簡便、特異的、敏感的檢測單基因甲基化的方式。其基本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因 組DNA,未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變,然后用3對特異性的引物對所測基因的同一核苷酸序列進行擴增。擴增產(chǎn)物用DNA瓊脂糖凝膠電泳,凝膠掃描觀察分析結(jié)果。
實驗材料

DNA

試劑、試劑盒

亞硫酸氫鈉、氫醌、石蠟油、乙醇

儀器、耗材

水浴鍋、PCR儀

實驗步驟

1.  在50 μl 體系中,DNA(2~5 μg)經(jīng)NaOH(終濃度值0.2 mol/L)在37℃變性10 Min。

2.  對于ng級別的人基因組DNA,在進行修飾前加入2μg蛙魚精DNA為載體。


3.  加入30 μl 剛配制好的10 mmo/L 氫醌與520/1的40.5%亞硫酸氫鈉混勻。

4.  然后用石蠟油隔絕空氣的條件下,避光在50%溫育16 h。


5.  修飾后的DNA過WizerdDNA純化柱,用50/1 L 水洗脫。

6.  室溫下用NaOH(終濃度為0.3 mol/L)修飾5 min,之后用乙醇沉淀。


7.  DNA溶于20 μl 水中,立即使用或在-20℃保存。

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