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當我們做免疫熒光的實驗時，市面上會有很多的染料供我們選擇，讓人眼花繚亂，那到底應(yīng)該如何選擇呢？讓我們看看以下介紹

一、熒光標記是什么？

熒光標記就是用熒光基團特異性來標記細胞或者組織樣品中所感興趣的區(qū)域。一般常用的熒光標記方法有表達熒光蛋白、細胞器及DNA特異性染料、抗體偶聯(lián)免疫熒光染料和雙光子熒光染料等。

 1）活細胞熒光標記選擇——熒光蛋白

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，簡稱GFP)，是一個由約238個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，從藍光到紫外線都能使其激發(fā)，發(fā)出綠色螢光。在研究中，我們可以將外源基因與GFP DNA進行相連，GFP可以作為外源基因的報告基因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達，對活細胞中的目的蛋白進行精準定位和動態(tài)觀察。后來GFP經(jīng)過科學家的改造，衍生出五顏六色的熒光蛋白。

GFP圖像

 2）免疫熒光染料

免疫學的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。對于表達量高的蛋白，可以在一抗上直接連接熒光基團進行標記，稱之為直接標記法。然而大部分樣品我們都是采用一抗二抗兩步的間接標記法進行信號放大，提升反應(yīng)靈敏性。

免疫熒光圖片

二、具體該如何選擇熒光染料？

（1）熒光亮度：熒光亮度越高，所需的激發(fā)光亮度就更低，可以使用更低的曝光時間進行拍攝。也可以減少光漂白及光毒性。

（2）光穩(wěn)定性：熒光基團的光穩(wěn)定性即抗漂白能力，越穩(wěn)定熒光越不容易淬滅。

（3）熒光濾光片：熒光染料的選取還要考慮設(shè)備本身具有的熒光濾光片，我司提供美國Omega專業(yè)熒光濾光片，幫助您完成不同染料的實驗。

常見的熒光染料
 

細胞器及DNA熒光染料

實驗中，常常需要對線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器以及DNA進行染色。

? 線粒體

觀察線粒體經(jīng)常用的染料就是MitoTracker，它是一種可以透過細胞的染料，有不同的顏色和修飾類型可供選擇。

▲藍色為DAPI標記細胞核，綠色為Alexa Fluor 488標記細胞微管，紅色為MitoTracker Red標記的線粒體

? 細胞核

標記細胞核的染料常用的是DAPI 358/461 nm和Hochest 350/460 nm。
區(qū)別是DAPI標記半通透細胞，能夠穿透細胞膜，可以用于固定和活細胞之中。Hochest染色劑毒性相對較低，比較適合標記活細胞。

▲DAPI標記細胞核，

三、如何選擇熒光觀察工具

常用的熒光觀察工具就是熒光顯微鏡了，而其中對于熒光效果重要的組件就是熒光濾光片，它的好壞決定了終成像的質(zhì)量及效果，我們使用美國Omega光學專為顯微熒光應(yīng)用設(shè)計的熒光濾光片，擁有50年的研發(fā)設(shè)計經(jīng)驗，效果優(yōu)于市面上常用的標配產(chǎn)品，極大的提高了熒光效果。

高透過率使熒光更亮、高截止使背景噪音更低，終實現(xiàn)更好的信噪比效果

科研級熒光顯微鏡

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