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主營產(chǎn)品： 進(jìn)口透析袋,密理博ECL發(fā)光液,B27無血清培養(yǎng)基,Gibco膠原酶 |
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2017-2-9 閱讀(4707)
一、胰蛋白酶（trypsin）溶液
胰蛋白酶是白色或淡黃色粉末，低溫干燥保存。主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。其活性以其消化酪蛋白的能力進(jìn)行測定。常用1:250（1:500）方法表示，即1份胰蛋白酶可以消化250份（或500份）酪蛋白。
胰蛋白酶對細(xì)胞的分離作用與細(xì)胞的類型和細(xì)胞的性質(zhì)關(guān)系密切。不同細(xì)胞系對胰蛋白酶溶液的濃度、溫度和作用時間等的要求也不相同。
無鈣鎂離子的平衡鹽溶液（常用于配制胰蛋白酶溶液或用于洗滌細(xì)胞）
NaCl 8g
KCl 0.20g
KH2PO4 0.02g
Na2HPO4 0.073g
葡萄糖 2.00g
酚紅 0.02g
溶于1000ml水中
染色體的G帶核型實驗中胰蛋白酶用生理鹽水配制。
二、EDTA溶液
又稱versene，一般用其鈉鹽，因可溶性較好。有些組織需要Ca2+、Mg2+來保持其完整性，用EDTA來排除這些離子，可使細(xì)胞之間裂解，以分散細(xì)胞。其作用比胰蛋白酶緩和。使用濃度為0.02%，以無鈣、鎂的平衡鹽溶液配制。
實驗室內(nèi)常將胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合使用。可提高消化效率，細(xì)胞分散情況改善。
EDTA不能被血清抑制，所以消化后必須*清洗。
EDTA對成纖維細(xì)胞作用差。
三、膠原酶溶液
1．用Hank's液配制成2000U/ml
2．36.5度攪拌溶解1h，4度通宵
3．濾過消毒
4．分裝成等份使用（1-2周內(nèi)）
5．長時間貯存在-20度
四、貼壁細(xì)胞——消化法——細(xì)胞懸液
1．吸除或倒掉瓶內(nèi)培養(yǎng)液。
2．以25cm2培養(yǎng)瓶為例，向瓶內(nèi)加入1ml消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加1ml消化液，輕輕搖動后再倒掉大部分消化液，僅留少許進(jìn)行消化。也可不采用上述步驟，直接加1-2ml消化液進(jìn)行消化，但要注意盡量減少消化液的剩余量，因為消化液過多對細(xì)胞有損傷，同時也需要較多的含血清培養(yǎng)液去中和。
3．消化在37度或室溫25度環(huán)境下進(jìn)行。消化2-5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化。
4．如僅用胰蛋白酶可直接加含血清的培養(yǎng)液，終止消化。
如用EDTA消化，需加Hank's液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶把殘留EDTA消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液，這個操作過程要十分小心，如果細(xì)胞已經(jīng)脫壁則消化液不能夠倒掉，以免丟失細(xì)胞，要加入Hank's液或培養(yǎng)液終止消化，吹打收集細(xì)胞懸液，離心漂洗去除EDTA。
5．用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，吹打過程要順序進(jìn)行，從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到。吹打時動作要輕柔不要用力過猛，同時盡量不要出現(xiàn)泡沫，這些都對細(xì)胞有損傷。細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。
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