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1、將抗原和淋巴細胞系在體外混合，刺激并預孵育，是通用的方法。預孵育的淋巴細胞，在置入ELISPOT板之前應使用復溫到37℃的培養(yǎng)液清洗細胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培養(yǎng)5～6小時。
2、對于高度特異性抗原，可以采用將淋巴細胞和抗原同時加入ELISPOT板孔中，37℃培養(yǎng)箱中，同步進行刺激、培養(yǎng)、和細胞因子捕獲。淋巴細胞板內同步刺激培養(yǎng)的時間通常為22～24小時。
3、ELISPOT試驗檢測的是每一個分泌細胞系因子的活化細胞。在培養(yǎng)細胞過程中，任何移動、震動（包括開關培養(yǎng)箱門）都會導致細胞在培養(yǎng)板上的移動，從而得到不規(guī)則斑點或者斑點花紋，影響zui終結果。因此細胞在ELISPOT培養(yǎng)板孵育的過程中，應注意保持培養(yǎng)板的靜置，不應對其移動。
4、在使用抗原刺激淋巴細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現培養(yǎng)液變黃，這種現象通常見于使用很強的多克隆抗原刺激淋巴細胞，某些多克隆抗原會導致淋巴細胞凋亡或者死亡，大量淋巴細胞死亡后使培養(yǎng)液變黃。使用這些淋巴細胞進行后續(xù)ELISPOT試驗通常得到很低的斑點（SPOT）形成。換用特異性抗原后可以避免該現象。
5、在ELISPOT結果中出現不規(guī)則的大塊斑點，有的區(qū)域沒有斑點的原因，不規(guī)則斑點區(qū)域的出現一般是細胞分離不*所至，有時候采用多克隆抗原孵育的淋巴細胞也會產生成團現象。請確認加入到ELISPOT板中進行孵育的是單細胞懸液。
6、使用開口較大的吸頭，動作輕柔，避免對細胞系的吹打，減少剪切力對淋巴細胞的傷害。
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