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real-time PCR，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟1、總RNA抽提（槍頭和離心管均經(jīng)過(guò)濕熱滅菌，無(wú)RNA酶）1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上預(yù)冷。2）取100mg組織，加入到勻漿器中
詳細(xì)介紹
real-time PCR，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟1、總RNA抽提（槍頭和離心管均經(jīng)過(guò)濕熱滅菌，無(wú)RNA酶）1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上預(yù)冷。2）取100mg組織，加入到勻漿器中。3）充分研磨直至無(wú)可見(jiàn)組織塊。4）13000g離心10min取上清。5）加入250 μl，顛倒離心管15s，充分混勻，靜置3min。6）4℃下13000g離心8min。7）將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。8）-20℃放置15min。9）4℃下13000g離心10min，管底的白色沉淀即為RNA。10）吸除液體，加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。11）4℃下13000g離心5min。12）將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺(tái)上吹3min。13）加入20μl無(wú)RNA酶的水溶解RNA。14）55℃孵育5min。2、反轉(zhuǎn)錄（槍頭和PCR均經(jīng)過(guò)濕熱滅菌，無(wú)RNA酶）1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。2）加入1μl oligo(dT)15。3）用無(wú)核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12μl。4）于PCR儀上70℃保溫5min，迅速置冰上冷卻。5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻。6）于PCR儀上42℃保溫60min，結(jié)束后80℃保溫5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。3、定量PCR1）取0.2ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。2× qPCR Mix 12.5μl7.5μM基因引物 2.0μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μlddH2O 8.0μl2）取0.2ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。2×qPCR Mix 12.5μl7.5μM內(nèi)參引物 2.0μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μlddH2O 8.0μl3）PCR擴(kuò)增預(yù)變性 95℃，10min循環(huán)（40次） 95℃，15s→60℃，60s溶解曲線 75℃→95℃，每20s升溫1℃4、結(jié)果處理ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測(cè)樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本)B=CT(目的基因，對(duì)照樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本)K=A-B表達(dá)倍數(shù)=2-K
real-time PCR