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Tunel

冰凍切片tunel實驗步驟1、 冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來復溫，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮*干后于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。2、 修復：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲存液用PBS 1:9稀釋）覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。3、 破膜：切片稍甩干后在圈內滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。4、 加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合（試劑1,2為現(xiàn)配現(xiàn)用），加到圈內覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37℃恒溫孵育2小時，濕盒內加少量水保持濕度。5、 阻斷內源性過氧化物酶：將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片放入用甲醇配制的3%過氧化氫溶液（過氧化氫：甲醇=1:9）室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。6、 加試劑3：切片稍甩干后，每張切片加適量試劑3(converter-POD）覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37℃溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。7、 DAB顯色：切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為細胞核呈棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。8、 復染細胞核：Harris蘇木素復染3min左右，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。9、 脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --無水乙醇Ⅰ6min -無水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。石蠟切片tunel實驗步驟1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。(冬天適當延長脫蠟時間）2、 修復：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲存液用PBS 1:9稀釋）覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。3、 破膜：切片稍甩干后在圈內滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。4、 加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合（試劑1,2為現(xiàn)配現(xiàn)用），加到圈內覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37℃恒溫孵育2小時，濕盒內加少量水保持濕度。5、 阻斷內源性過氧化物酶：將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片放入用甲醇配制的3%過氧化氫溶液（過氧化氫：甲醇=1:9）室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。6、 加試劑3：切片稍甩干后，每張切片加適量試劑3(converter-POD）覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37℃溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。7、 DAB顯色：切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為細胞核呈棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。8、 復染細胞核：Harris蘇木素復染3min左右，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。9、 脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --無水乙醇Ⅰ6min -無水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。Tunel

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