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北京林大陳少良:REM6.5 激活質(zhì)膜質(zhì)子泵促植物耐鹽

閱讀:362        發(fā)布時間:2020-11-26
NMT作為生命科學(xué)底層核心技術(shù),是建立活體創(chuàng)新科研平臺的*技術(shù)。2005年~2020年,NMT已扎根中國15年。2020年,中國NMT銷往瑞士蘇黎世大學(xué),正式打開歐洲市場。

 

 

基本信息

主題:REM6.5 激活質(zhì)膜質(zhì)子泵促植物耐鹽

期刊:Tree Physiology

影響因子:3.477

研究使用平臺:NMT植物耐鹽創(chuàng)新平臺

標(biāo)題:Populus euphratica remorin 6.5 activates plasma membrane H+-ATPases to mediate salt tolerance

作者:北京林業(yè)大學(xué)陳少良、張會龍

 

檢測離子/分子指標(biāo)

 

Na+,H+,K+

 

檢測樣品

7日齡擬南芥(WT和轉(zhuǎn)基因)根分生區(qū)(距根尖200µm根表上的點)

 

中文摘要(谷歌機(jī)翻)

 

Remorins(REM)在植物適應(yīng)不利環(huán)境的能力中起著重要作用。PeREM6.5是胡楊,耐鹽楊樹中REM家族的一種蛋白質(zhì),是由愈傷組織,根和葉中的NaCl脅迫誘導(dǎo)的。我們從胡楊假單胞菌中克隆了全長PeREM6.5,并將其轉(zhuǎn)化為大腸桿菌和擬南芥。PeREM6.5重組蛋白顯著提高了胡楊質(zhì)膜(PM)囊泡中的H ATPase水解活性和H+轉(zhuǎn)運活性。酵母雜交分析表明,胡楊REM6.5RPM1相互作用蛋白4(PeRIN4)相互作用。PeRI N4重組蛋白增強了PeREM6.5誘導(dǎo)的PM H+ -ATPase活性的增加,在擬南芥中PeREM6.5的正向表達(dá)在存活率,根生長,電解質(zhì)滲漏和丙二醛含量方面顯著提高了轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。過表達(dá)PeREM6.5的擬南芥植物在體內(nèi)和體外試驗中均保持較高的PM H+ -ATPase活性。由于H+ -ATPases促進(jìn)了Na的擠出,PeREM6.5轉(zhuǎn)基因植物的Na積累減少,而且H+泵引起了血漿膜的每極化,降低了鹽堿化根系PM中去極化激活通道介導(dǎo)的K+損失,因此,我們得出以下結(jié)論:帽子PeREM6.5調(diào)節(jié)了PM中的H+ -ATPase活性,從而增強了植物在鹽度下保持離子穩(wěn)態(tài)的能力。

 

離子/分子流實驗處理方法

 

(1)125 mM NaCl處理12小時
2)500 μM釩酸鈉處理20分鐘

離子/分子流實驗結(jié)果

 

使用NMT技術(shù),在低Na+測試液中記錄了來自對照和鹽處理植物根部的Na+外排。NaCl處理(12 h)導(dǎo)致所有測試株系的Na+外排顯著增加(圖1A)。轉(zhuǎn)基因植物在NaCl處理后表現(xiàn)出比WT植物更高的Na+外排(圖1A)。在所有測試株系中,NaCl均增加了K+的外排,但WT中的K+損失高于轉(zhuǎn)基因植物(圖1B

圖1

在NaCl處理下,H+由內(nèi)流轉(zhuǎn)為外排,轉(zhuǎn)基因植物中的H+外排顯著高于野生型植物(圖2A)。但是,鹽誘導(dǎo)的H+外排被質(zhì)膜(PM)H+-ATPase的特異性抑制劑釩酸鈉消除(圖2A)。該結(jié)果表明鹽誘導(dǎo)的H+外排是由H+泵活性增加引起的。H+外排在轉(zhuǎn)基因植物中更為明顯的事實表明,轉(zhuǎn)基因植物在NaCl脅迫下仍具有較高的H+泵活性。

PeREM6.5-轉(zhuǎn)基因植物的根在鹽脅迫下表現(xiàn)出比野生型植物的根更高的PM超極化(-63±2 mV),盡管在無對照植物中膜電位相似(-82±3 mV;圖2B)。膜電位越負(fù),說明PM中的H+泵活性越高

PeREM6.5-轉(zhuǎn)基因擬南芥中分離的PM囊泡進(jìn)行了PM H+-ATPase活性的體外測定。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植物通常表現(xiàn)出更高的ATP水解活性(2.1倍;圖2C)。因此,PeREM6.5上調(diào)了轉(zhuǎn)基因株系中PM H+-ATPase的活性。這一發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)基因擬南芥根系中H+轉(zhuǎn)運活性增加的體內(nèi)協(xié)調(diào)一致(圖2A)。綜上所述,PeREM6.5可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥中PM H+-ATPase的活性。

圖2

 

其他實驗結(jié)果

 

 

  • 無論NaCl濃度如何,胡楊PeREM6.5在愈傷組織、根和地上部分均對NaCl脅迫有響應(yīng)。

  •  

    從胡楊葉中克隆了PeREM6.5的cDNA全長1130bp。PeREM6.5氨基酸序列與populus trichocarpa(PtREM)的相似性高。結(jié)構(gòu)分析預(yù)測PeREM6.5蛋白質(zhì)是典型的Remorin-C結(jié)構(gòu)域。

  • 共聚焦激光掃描顯微鏡結(jié)果表明,PeREM定位于PM和細(xì)胞質(zhì)。此外,PeREM6.5與PM標(biāo)記FM4-64部分共定位,表明PeREM6.5是與PM相關(guān)的蛋白質(zhì)。

  • PeREM6.5與PeRIN4相互作用,提高胡楊PM H+-ATPase的酶活性

  • 半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR和RT-qPCR顯示,OE2、OE15和OE21表達(dá)的PeREM6.5轉(zhuǎn)錄水平高于其他株系。

  • PeREM6.5過表達(dá)提高了擬南芥的耐鹽性。

  • 鹽處理(12h)顯著增加了所有試驗株系的根細(xì)胞內(nèi)Na+濃度。然而,轉(zhuǎn)基因株系中的Na+特異性熒光低于野生型。與鹽漬化根相比,在對照條件下熒光強度幾乎無法檢測。

結(jié)論

 

基于我們的研究結(jié)果,我們得出結(jié)論:PeREM6.5介導(dǎo)了胡楊的H+泵活性。鹽處理誘導(dǎo)了胡楊中REM6.5的表達(dá),編碼蛋白與PeRIN4相互作用,穩(wěn)定了H+-ATPase復(fù)合物,從而提高了PM H+-ATPase的活性。因此,PeREM6.5-PeRIN4-蛋白復(fù)合物激活的H+-泵通過Ca2+-SOS途徑促進(jìn)Na+/H+反轉(zhuǎn)運。此外,活化的PM H+-ATPase保留較少的去極化PM,限制K+通過DA-KORC和DA-NSCC外排。結(jié)果表明,鹽堿環(huán)境下胡楊屬植物保持了K+/Na+的動態(tài)平衡

 

離子流實驗使用的測試液

 

0.5 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM NaCl, 2.5% sucrose, pH 5.8

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