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基本信息

主題：REM6.5 激活質(zhì)膜質(zhì)子泵促植物耐鹽

期刊：Tree Physiology

影響因子：3.477

研究使用平臺：NMT植物耐鹽創(chuàng)新平臺

標(biāo)題：Populus euphratica remorin 6.5 activates plasma membrane H⁺-ATPases to mediate salt tolerance

作者：北京林業(yè)大學(xué)陳少良、張會龍

檢測離子/分子指標(biāo)

Na⁺，H⁺，K⁺

檢測樣品

7日齡擬南芥（WT和轉(zhuǎn)基因）根分生區(qū)（距根尖200µm根表上的點）

中文摘要（谷歌機(jī)翻）

Remorins（REM）在植物適應(yīng)不利環(huán)境的能力中起著重要作用。PeREM6.5是胡楊，耐鹽楊樹中REM家族的一種蛋白質(zhì)，是由愈傷組織，根和葉中的NaCl脅迫誘導(dǎo)的。我們從胡楊假單胞菌中克隆了全長PeREM6.5，并將其轉(zhuǎn)化為大腸桿菌和擬南芥。PeREM6.5重組蛋白顯著提高了胡楊質(zhì)膜（PM）囊泡中的H ATPase水解活性和H⁺轉(zhuǎn)運活性。酵母雜交分析表明，胡楊REM6.5與RPM1相互作用蛋白4（PeRIN4）相互作用。PeRI N4重組蛋白增強了PeREM6.5誘導(dǎo)的PM H⁺ -ATPase活性的增加，在擬南芥中PeREM6.5的正向表達(dá)在存活率，根生長，電解質(zhì)滲漏和丙二醛含量方面顯著提高了轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。過表達(dá)PeREM6.5的擬南芥植物在體內(nèi)和體外試驗中均保持較高的PM H⁺ -ATPase活性。由于H⁺ -ATPases促進(jìn)了Na的擠出，PeREM6.5轉(zhuǎn)基因植物的Na積累減少，而且H⁺泵引起了血漿膜的每極化，降低了鹽堿化根系PM中去極化激活通道介導(dǎo)的K⁺損失，因此，我們得出以下結(jié)論：帽子PeREM6.5調(diào)節(jié)了PM中的H⁺ -ATPase活性，從而增強了植物在鹽度下保持離子穩(wěn)態(tài)的能力。

離子/分子流實驗處理方法

（1）125 mM NaCl處理12小時
（2）500 μM釩酸鈉處理20分鐘

離子/分子流實驗結(jié)果

使用NMT技術(shù)，在低Na⁺測試液中記錄了來自對照和鹽處理植物根部的Na⁺外排。NaCl處理（12 h）導(dǎo)致所有測試株系的Na⁺外排顯著增加（圖1A）。轉(zhuǎn)基因植物在NaCl處理后表現(xiàn)出比WT植物更高的Na⁺外排（圖1A）。在所有測試株系中，NaCl均增加了K⁺的外排，但WT中的K⁺損失高于轉(zhuǎn)基因植物（圖1B）。

圖1

在NaCl處理下，H⁺由內(nèi)流轉(zhuǎn)為外排，轉(zhuǎn)基因植物中的H⁺外排顯著高于野生型植物（圖2A）。但是，鹽誘導(dǎo)的H⁺外排被質(zhì)膜（PM）H⁺-ATPase的特異性抑制劑釩酸鈉消除（圖2A）。該結(jié)果表明鹽誘導(dǎo)的H⁺外排是由H⁺泵活性增加引起的。H⁺外排在轉(zhuǎn)基因植物中更為明顯的事實表明，轉(zhuǎn)基因植物在NaCl脅迫下仍具有較高的H⁺泵活性。

PeREM6.5-轉(zhuǎn)基因植物的根在鹽脅迫下表現(xiàn)出比野生型植物的根更高的PM超極化（-63±2 mV），盡管在無對照植物中膜電位相似（-82±3 mV；圖2B）。膜電位越負(fù)，說明PM中的H⁺泵活性越高。

對PeREM6.5-轉(zhuǎn)基因擬南芥中分離的PM囊泡進(jìn)行了PM H⁺-ATPase活性的體外測定。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植物通常表現(xiàn)出更高的ATP水解活性（2.1倍；圖2C）。因此，PeREM6.5上調(diào)了轉(zhuǎn)基因株系中PM H⁺-ATPase的活性。這一發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)基因擬南芥根系中H⁺轉(zhuǎn)運活性增加的體內(nèi)協(xié)調(diào)一致（圖2A）。綜上所述，PeREM6.5可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥中PM H⁺-ATPase的活性。

圖2

其他實驗結(jié)果

• 無論NaCl濃度如何，胡楊PeREM6.5在愈傷組織、根和地上部分均對NaCl脅迫有響應(yīng)。

•  

  從胡楊葉中克隆了PeREM6.5的cDNA全長1130bp。PeREM6.5氨基酸序列與populus trichocarpa（PtREM）的相似性高。結(jié)構(gòu)分析預(yù)測PeREM6.5蛋白質(zhì)是典型的Remorin-C結(jié)構(gòu)域。

• 共聚焦激光掃描顯微鏡結(jié)果表明，PeREM定位于PM和細(xì)胞質(zhì)。此外，PeREM6.5與PM標(biāo)記FM4-64部分共定位，表明PeREM6.5是與PM相關(guān)的蛋白質(zhì)。

• PeREM6.5與PeRIN4相互作用，提高胡楊PM H⁺-ATPase的酶活性。

• 半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR和RT-qPCR顯示，OE2、OE15和OE21表達(dá)的PeREM6.5轉(zhuǎn)錄水平高于其他株系。

• PeREM6.5過表達(dá)提高了擬南芥的耐鹽性。

• 鹽處理（12h）顯著增加了所有試驗株系的根細(xì)胞內(nèi)Na⁺濃度。然而，轉(zhuǎn)基因株系中的Na⁺特異性熒光低于野生型。與鹽漬化根相比，在對照條件下熒光強度幾乎無法檢測。

結(jié)論

基于我們的研究結(jié)果，我們得出結(jié)論：PeREM6.5介導(dǎo)了胡楊的H⁺泵活性。鹽處理誘導(dǎo)了胡楊中REM6.5的表達(dá)，編碼蛋白與PeRIN4相互作用，穩(wěn)定了H⁺-ATPase復(fù)合物，從而提高了PM H⁺-ATPase的活性。因此，PeREM6.5-PeRIN4-蛋白復(fù)合物激活的H⁺-泵通過Ca²⁺-SOS途徑促進(jìn)Na⁺/H⁺反轉(zhuǎn)運。此外，活化的PM H⁺-ATPase保留較少的去極化PM，限制K⁺通過DA-KORC和DA-NSCC外排。結(jié)果表明，鹽堿環(huán)境下胡楊屬植物保持了K⁺/Na⁺的動態(tài)平衡。

離子流實驗使用的測試液

0.5 mM KCl, 0.1 mM CaCl₂, 0.1 mM MgCl₂, 0.1 mM NaCl, 2.5% sucrose, pH 5.8