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基本信息

主題：NMT發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元線粒體耗O₂速率增加為Bcl2家族改善神經(jīng)元代謝提供直接證據(jù)

期刊：Nature cell biology

影響因子：20.042

研究使用平臺：NMT神經(jīng)研究創(chuàng)新平臺

標(biāo)題：Bcl-x_L regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F₁F₀ ATP synthase

作者：耶魯大學(xué)Elizabeth A. Jonas、Kambiz N. Alavian

檢測離子/分子指標(biāo)

O₂

檢測樣品

大鼠海馬神經(jīng)元

中文摘要（谷歌機翻）
 

離子/分子流實驗處理

① GFP-Bcl-x_L表達(dá)神經(jīng)元與mito-GFP表達(dá)神經(jīng)元CSCW2-熒光素酶慢病毒轉(zhuǎn)染7 d

② 單個不表達(dá)神經(jīng)元或表達(dá)Bcl-x_L shRNA或混亂shRNA的神經(jīng)元CSCW2-熒光素酶慢病毒轉(zhuǎn)染7 d

③ 單個神經(jīng)元10 μM ABT-737處理18 h

④ 90 mM KCl和5 mg ml^-1寡霉素處理表達(dá)Bcl-x_L-GFP或mito-GFP的單個神經(jīng)元

⑤ 螢火蟲熒光素酶在有無1 μM ABT-737處理海馬神經(jīng)元中的發(fā)光5 min，隨后用90 mM KCl處理90 s。

先前的工作描述了過表達(dá)Bcl-x_L的神經(jīng)元中線粒體生物量的增加。如果線粒體生物量的增加是造成ATP水平升高的原因，那么表達(dá)Bcl-x_L的細(xì)胞有望增加攝氧量。為了驗證這一點，使用O₂流速微傳感器檢測單個神經(jīng)元的氧攝取量。與預(yù)期相反，過表達(dá)Bcl-x_L的神經(jīng)元的O₂流速低于轉(zhuǎn)染mito-GFP的神經(jīng)元（圖1b），這表明過表達(dá)Bcl-x_L的神經(jīng)元更有效地將ATP的產(chǎn)生與O₂的吸收結(jié)合。內(nèi)源性Bcl-x_L具有類似的作用，因為shRNA介導(dǎo)的消耗（圖1c, d）或Bcl-x_L活性的藥理抑制作用（圖1e）增加了神經(jīng)元的O₂流速。這些數(shù)據(jù)表明，Bcl-x_L的消耗或抑制使ATP的產(chǎn)生與O₂的攝取解偶聯(lián)。

從理論上講，較高的ATP水平和過表達(dá)Bcl-x_L的神經(jīng)元的O₂攝取水平較低，可能是由于電活動和突觸活動水平降低而導(dǎo)致ATP積累的靜止?fàn)顟B(tài)。這不太可能，是因為Bcl-x_L過表達(dá)的神經(jīng)元具有比對照更大的突觸和更多的自發(fā)活動。

因此，作者研究了過表達(dá)Bcl-x_L的神經(jīng)元是否具有更大但未被充分利用的能量。當(dāng)細(xì)胞在高鉀條件下去極化時，Bcl-x_L過表達(dá)的神經(jīng)元O₂流速比基礎(chǔ)水平增加了約90%，這是一種已知的刺激神經(jīng)元電活動和突觸活動的處理方法（圖1f），而mito-GFP表達(dá)對照則僅增加了50%。

在氧化磷酸化過程中，從線粒體基質(zhì)中泵出的質(zhì)子通過ATP合成酶處的線粒體內(nèi)膜的H⁺流速（生產(chǎn)流速）和H⁺外排（非生產(chǎn)性）重新進(jìn)入基質(zhì)。減少非生產(chǎn)性外排可提高ATP生產(chǎn)效率。為了確定Bcl-x_L過表達(dá)的神經(jīng)元在大活性期間是否有不同程度的非生產(chǎn)性穿過內(nèi)膜的外排，高鉀被迅速沖洗出去，并在寡霉素中測量O₂攝取量，寡霉素抑制與ATP生成相關(guān)的H⁺流速，但不抑制與非生產(chǎn)性外排相關(guān)的H⁺流速。與mito-GFP表達(dá)對照相比，GFP-Bcl-x_L細(xì)胞具有更高的產(chǎn)O₂流速與總O₂流速的比值，表明它們利用更高的整體峰值O₂流速百分比來制造ATP（圖1g）。

圖1. Bcl-x_L改變神經(jīng)元對O₂的吸收

其他實驗結(jié)果

• Bcl-x_L過表達(dá)的神經(jīng)元ATP水平升高，Bcl-x_L缺失的神經(jīng)元ATP水平降低。

• Bcl-x_L是刺激引起的代謝變化所必需的。

• Bcl-x_L定位于線粒體內(nèi)膜。

• 重組Bcl-x_L蛋白增強了F₁F₀ ATPase的酶促速率。
• 在F₁F₀ ATPase活動期間，Bcl-x_L抑制減弱H⁺進(jìn)入亞線粒體囊泡。

• 內(nèi)源性Bcl-x_L是ATP結(jié)合后抑制膜泄漏所必需的。

• Bcl-x_L增加線粒體ATP的產(chǎn)生，可使細(xì)胞在缺乏Bax或Bak的情況下免受代謝損害。

結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Bcl-x_L的神經(jīng)元具有較高的ATP水平，而內(nèi)源性Bcl-x_L被消耗或抑制的細(xì)胞具有較低的ATP水平。盡管ATP水平升高，但過表達(dá)Bcl-x_L的神經(jīng)元耗氧量較少，Bcl-x_L消耗增加了氧攝取水平。除其外膜定位外，研究通過免疫電鏡在線粒體基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)Bcl-x_L。Bcl-x_L與F₁F₀ ATP合酶的β亞基免疫共沉淀，與純化的F1 ATP合酶重組β亞基結(jié)合。外源施加Bcl-x_L使F₁F₀ ATPase活性水平升高，Bcl-x_L抑制使酶促速率降低。Bcl-x_L缺失使含F(xiàn)₁F₀-ATPase的遞質(zhì)線粒體囊泡對H⁺離子的隔離能力下降，表明Bcl-x_L消耗引起質(zhì)子在激活該酶后外排。通過膜片鉗檢測暴露于ATP的含F(xiàn)₁F₀-ATPase的囊泡，記錄到Bcl-x_L被抑制或耗盡時外滲電導(dǎo)增加。因此，本研究提出了一個模型，其中Bcl-x_L通過減少F₁F₀ ATPase中的質(zhì)子外排來提高ATP合成的效率，從而改善神經(jīng)元的新陳代謝。

測試液

90 mM KCl, 64 mM NaCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl₂, pH 7.4