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NMT發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下耐鹽楊樹根吸氧更多促線粒體呼吸以激活H+泵促排Na+
NMT作為生命科學(xué)底層核心技術(shù)，是建立活體創(chuàng)新科研平臺的*技術(shù)。2005年~2020年，NMT已扎根中國15年。2020年，中國NMT銷往瑞士蘇黎世大學(xué)，正式打開歐洲市場。
基本信息
主題：NMT發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下耐鹽楊樹根吸氧更多促線粒體呼吸以激活H+泵促排Na+
期刊：Tree Physiology
影響因子：3.665
研究使用平臺：NMT植物耐鹽創(chuàng)新平臺
標(biāo)題：NaCl-altered oxygen flux profiles and H+-ATPase activity in roots of two contrasting poplar species
作者：北京林業(yè)大學(xué)陳少良、馬秀英、鄧晨、李金克
檢測離子/分子指標(biāo)
O2，Na+，H+
檢測樣品
胡楊（Poplus euphratica）、群眾楊（Poplus popularis）的根，距根尖100、600、1100、1600、2100、2600、10000、10500、11000、11500、12000、12500 μm根表上的點。
中文摘要（谷歌機(jī)翻）
維持線粒體呼吸對于H+泵ATP在鹽脅迫下排出Na+至關(guān)重要。本文研究了NaCl脅迫對胡楊（耐鹽）和群眾楊35-44（鹽敏感）O2吸收、線粒體呼吸和H+-ATPase活性的影響。與群眾楊相比，胡楊根系在NaCl脅迫（150 mM）下表現(xiàn)出更強(qiáng)的Na+外排能力。用Pb(NO3)2染色進(jìn)行的細(xì)胞化學(xué)分析表明，在長期（LT）增加鹽脅迫（50~200 mM NaCl, 4周）的過程中，胡楊根細(xì)胞比鹽敏感的楊樹保留了更高的H+水解活性。質(zhì)子泵的長期持續(xù)激活需要通過有氧呼吸來提供持久的能量（ATP）。利用非損傷微測技術(shù)（NMT）對鹽脅迫下根系O2吸收的種類、空間和時間差異進(jìn)行了研究。雖然鹽誘導(dǎo)的O2瞬態(tài)動態(tài)變化與高滲沖擊（255 mM甘露醇）引起的O2的劇烈下降有明顯區(qū)別，但胡楊在NaCl實時處理（150 mM）時的吸氧量下降幅度小于群眾楊。短期（ST）處理（150 mM NaCl, 24 h）刺激了胡楊根系O2的內(nèi)流，LT處理胡楊根系O2的內(nèi)流速率沿根軸增加，而群眾楊的根系O2內(nèi)流速率則隨鹽度的增加而下降。在ST和LT脅迫期間，高濃度NaCl（150、200 mM）處理下，O2內(nèi)流速率的空間定位表明，根尖區(qū)比伸長區(qū)更易受到影響。藥理學(xué)實驗表明，當(dāng)線粒體呼吸抑制劑NaN3抑制O2的吸收時，鹽漬化的根中的Na+外排和H+-ATPase活性會受到相應(yīng)的抑制。因此研究認(rèn)為，穩(wěn)定的線粒體呼吸使胡楊根細(xì)胞的H+-ATPase能在鹽環(huán)境下維持Na+穩(wěn)態(tài)。
離子/分子流實驗處理
1. 150 mM NaCl或255 mM等滲甘露醇實時處理。
2. 短期脅迫（ST）：150 mM NaCl脅迫24 h。
3. ST脅迫之后，2 mM NaN3（線粒體呼吸抑制劑）處理20 min。
4. 長期脅迫（LT）：NaCl濃度從50 mM開始，每周增加50 mM，最后一周達(dá)到200 mM。
離子/分子流實驗結(jié)果
利用NMT在通常觀察到峰值的根尖區(qū)和伸長區(qū)檢測O2流速。流速數(shù)據(jù)顯示，兩種楊樹根系均有O2的凈流入，但群眾楊的流速比胡楊的流速大30~42 pmol cm-2s-1（圖1）。根尖區(qū)（距根尖0.1~2.6 mm）O2內(nèi)流速率大于伸長區(qū)（距葉尖10.0~12.5 mm, 圖1）。
圖1. 胡楊和群眾楊根尖區(qū)和伸長區(qū)O2內(nèi)流。
在距根尖1.1 mm的根尖區(qū)檢測O2流速對NaCl或高滲脅迫（甘露醇）的響應(yīng)。NaCl（150 mM）的加入使兩種楊樹的O2流速立即降低，且隨著鹽脅迫時間的延長，流速逐漸降低（圖2A）。與耐鹽楊樹相比，鹽敏感的群眾楊O2內(nèi)流速率下降的更為明顯（圖2A, B）。NaCl實時脅迫10 min后胡楊O2流速趨于穩(wěn)定，而群眾楊O2流速持續(xù)下降，直至觀察時間結(jié)束（圖2A）。
高滲處理的楊樹根系O2實時動態(tài)變化與NaCl實時處理的根系不同。在受到255 mM甘露醇引起的等滲脅迫后，胡楊和群眾楊的O2內(nèi)流立即減少48~57%，隨后在記錄期間內(nèi)保持恒定（圖2C）。實時流速數(shù)據(jù)顯示，高滲處理對O2內(nèi)流產(chǎn)生了比鹽離子更明顯的限制作用（圖2B, D）。
圖2. NaCl和高滲脅迫實時處理對胡楊和群眾楊根部O2實時動態(tài)變化的影響。
150 mM NaCl 短期（ST, 24 h）處理后，胡楊根系穩(wěn)態(tài)O2流速的模式與群眾楊不同。研究觀察到ST處理后的胡楊根系氧內(nèi)流速率增加（圖3A）。在群眾楊根系中，NaCl處理降低了根尖區(qū)的O2流速，但在伸長區(qū)的O2流速變化不明顯（圖3B）。為確定鹽刺激的胡楊根系O2內(nèi)流是否是線粒體呼吸被激活的結(jié)果，采用線粒體呼吸抑制劑NaN3抑制細(xì)胞色素途徑。抑制劑NaN3顯著降低了NaCl脅迫下胡楊根中O2的內(nèi)流（圖3C），表明ST處理激活了胡楊根細(xì)胞的線粒體呼吸。抑制劑NaN3能夠顯著降低ST處理下群眾楊根系中O2的內(nèi)流速率（圖3D），表明植物的線粒體呼吸受到嚴(yán)重抑制。
圖3. NaCl和線粒體呼吸抑制劑（NaN3）對胡楊和群眾楊根部穩(wěn)態(tài)O2流速的影響。
群眾楊是一種鹽敏感樹種，因此在4周的處理中以50、100、150、200 mM遞增的方式增加鹽分。 在增加鹽分處理期間每周檢查穩(wěn)態(tài)O2流速。胡楊和群眾楊在50 mM NaCl脅迫1周后，沿根軸O2內(nèi)流速率增加，盡管耐鹽楊樹受到了更明顯的刺激（圖4A, B）。然而，在第2周100 mM NaCl脅迫下，群眾楊不存在鹽刺激的O2吸收（圖4D）。本研究注意到，暴露在較高鹽度下，即第3周150 mM NaCl和第4周200 mM NaCl，引起了群眾楊中O2內(nèi)流速率的顯著下降，且這種影響在根尖區(qū)更為明顯（圖4F, H）。與鹽敏感楊樹相比，在鹽脅迫期間，胡楊表現(xiàn)出沿根軸的O2內(nèi)流增加，但刺激效果隨鹽度的增加而下降（圖4A, C, E, G） 。
圖4. 長期增加NaCl對胡楊和群眾楊根部O2流速的影響。
木本植物和草本植物的耐鹽性在很大程度上是由Na+從細(xì)胞質(zhì)中排出所介導(dǎo)的。為證實鹽環(huán)境下胡楊根細(xì)胞穩(wěn)定的線粒體呼吸是否能激活H+-ATPase以維持Na+穩(wěn)態(tài)，本研究在鹽脅迫下，檢測了線粒體呼吸抑制劑NaN3對Na+外排和體內(nèi)H+-ATPase活性的影響。NaCl（150 mM, 24 h）引起兩種楊樹根尖Na+外排顯著增加（圖5A）。值得注意的是，在NaCl處理下胡楊根系的Na+外排速率明顯高于群眾楊（圖5A）。然而，抑制劑NaN3顯著降低了NaCl脅迫下根系Na+外排速率（圖5A），表明線粒體呼吸受到抑制后，Na+外排減少。在無鹽對照條件下，NaN3沒有明顯改變Na+流速，這在兩種楊樹中幾乎無法檢測到（圖5A）。
用NMT研究了NaCl脅迫下根中PM H+-ATPase的活性。NaCl處理（150 mM, 24 h）使H+的凈內(nèi)流速率在兩個楊樹根系中增加（圖5B），這是Na+/H+跨PM逆向轉(zhuǎn)運所致的（圖5A, B）。NaN3增加了鹽刺激下的H+內(nèi)流（圖5B），而抑制劑處理的根系中沒有相應(yīng)的增加Na+外排（圖5A）。因此，抑制劑引起的H+內(nèi)流主要是由質(zhì)膜H+-ATPase產(chǎn)生的H+外排減少引起的。此外，NaN3導(dǎo)致兩種楊樹對照根中H+內(nèi)流的增加（圖5B），這是由于抑制劑處理下根中H+泵活性降低所致。
圖5. NaCl和線粒體呼吸抑制劑（NaN3）對胡楊和群眾楊根系Na+和H+穩(wěn)態(tài)流速的影響。
圖6. 植物根部檢測圖
其他實驗結(jié)果
- 50 mM NaCl處理1周后，群眾楊根部的整體呼吸量增加。然而，隨著NaCl濃度和鹽脅迫時間的增加，群眾楊根部的呼吸速率呈下降趨勢。與群眾楊相反，NaCl處理的胡楊根的呼吸速率在處理1周后明顯增加，在隨后的3周鹽脅迫中仍比對照植物高36~44%。
- 細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，鹽脅迫1周后，胡楊和群眾楊皮層細(xì)胞的質(zhì)膜中染色強(qiáng)度增加。然而，在高NaCl處理的最后2周（150, 200 mM），群眾楊細(xì)胞中H+-ATPase的活性明顯下降。與群眾楊樹相比，胡楊根細(xì)胞在高鹽處理期間保持了H+-ATPase的活性。
結(jié)論
氧流速數(shù)據(jù)表明，在實時鹽脅迫、ST和LT鹽脅迫下，胡楊根系表現(xiàn)出較強(qiáng)的維持線粒體呼吸的能力。在鹽環(huán)境下，穩(wěn)定的線粒體呼吸使胡楊根細(xì)胞的H+-ATPase能在鹽環(huán)境下維持Na+穩(wěn)態(tài)。
測試液
O2：0.1 mM CaCl2, 0.5 mM KCl, pH 6.0
Na+、H+：0.5 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM NaCl, 2.5% sucrose, pH 5.8
儀器采購信息
- 據(jù)中關(guān)村NMT產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟了解，北京林業(yè)大學(xué)于2009年采購了美國揚格公司的非損傷微測系統(tǒng)。