實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)：MTT檢測(cè)超聲激活血卟啉對(duì)SW-480細(xì)胞的殺傷作用

　　研究方向：超聲醫(yī)療

　　測(cè)試目的：

　　自提出激光與血卟啉結(jié)合具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)，PDT法在診治腫瘤方面已做了大量研究并在臨床中得到應(yīng)用。但由于激光對(duì)組織穿透力較差，使PDT對(duì)深層腫瘤的治療受到限制。與激光相比，超聲是一種機(jī)械波，它對(duì)生物組織有較強(qiáng)的穿透力，并可無(wú)創(chuàng)傷地將聲能聚焦于深層組織。超聲可激活包括有機(jī)光敏(如血卟啉)在內(nèi)的某些藥物，產(chǎn)生比單純超聲更加明顯的抗腫瘤效應(yīng)。超聲結(jié)合光敏劑治療腫瘤的方法被稱(chēng)為聲動(dòng)力學(xué)療法（簡(jiǎn)稱(chēng)SDT）。迄今為止國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究多集中于單一介質(zhì)中SDT法對(duì)腫瘤殺傷作用的探討。本文選擇體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480，用不同頻率聚焦超聲激活血卟咻的方法處理不同介質(zhì)中的腫瘤細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的損傷結(jié)果，為探討SDT的殺傷機(jī)理積累資料。

　　測(cè)試設(shè)備：ATA-8202功率放大器、換能器、照射水槽、溫度計(jì)、微型低速點(diǎn)擊、CO2培養(yǎng)箱。

　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

　　待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，消化細(xì)胞，分別用NaC1、PRMI1640、培養(yǎng)基(M)將細(xì)胞密度調(diào)至1X106cells/mL。隨后，細(xì)胞分為四組：(1)對(duì)照一組：細(xì)胞懸液，不進(jìn)行超聲處理，(2)對(duì)照二組：加入血卟啉的細(xì)胞懸液，不進(jìn)行超聲處理，37℃孵育30min，(3)實(shí)驗(yàn)一組為單純超聲照射組。細(xì)胞直接進(jìn)行超聲照射，(4)實(shí)驗(yàn)二組為超聲+血卟啉組，細(xì)胞懸液中加入血卟啉(終濃度為0.lmg/mL)，37C℃孵育30min，之后進(jìn)行超聲照射。聲照頻率分別為1.1，1.6，2.3MHz；各頻率照射聲強(qiáng)均為1.5W/cm2。

　　超聲處理后四組細(xì)胞分別接種于96孔板中，每個(gè)處理設(shè)4-5個(gè)復(fù)孔，每孔接種0.lmL細(xì)胞懸液及0.01mLMTT溶液。以上操作均在避光條件下進(jìn)行。接種后的96孔板于CO2孵箱中孵育4h后，離心25分鐘(4000rpm)，吸棄上清，每孔加0.2mLDMSO(分析純)，酶標(biāo)儀檢測(cè)光吸收值(A值)，計(jì)算相對(duì)存活率(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)。

　　各實(shí)驗(yàn)組所得數(shù)據(jù)列表如下：表1、表2、表3分別顯示在NaC1溶液、PRMI1640、培養(yǎng)基中SW-480細(xì)胞經(jīng)1.1，1.6，2.3MHz，1.5W/cm2超聲輻照后MTT解育4小時(shí)后細(xì)胞的相對(duì)存活率，圖1顯示SW-480細(xì)胞在不同溶液中經(jīng)2.3MHz，1.5W/cm2超聲輻照后MTT解育4h后的細(xì)胞相對(duì)存活率，表4顯示在Nac1、PRMI1640、培養(yǎng)基中SW-480細(xì)胞經(jīng)23.MHz，1.5W/cm2超聲輻照12h后MTT解育4h后細(xì)胞的相對(duì)存活率。

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

　　當(dāng)聲照強(qiáng)度為1.5W/cm2時(shí)，在2.3MHz頻率的單純超聲照射下，SW-480細(xì)胞在NaCI溶液和培養(yǎng)基中細(xì)胞的相對(duì)存活率都接近100%，在PRMI1640溶液中，細(xì)胞的相對(duì)存活率達(dá)120%，說(shuō)明2.3MHz頻率的單純超聲照射對(duì)SW-480細(xì)胞幾乎沒(méi)有殺傷作用，反而有輕微的促生長(zhǎng)作用。而在以上三種溶液中，發(fā)現(xiàn)在2.3MHz頻率下超聲+血卟啉照射使SW-480細(xì)胞的死亡率明顯增加，經(jīng)t檢驗(yàn)，A，B兩組的結(jié)果之間存在極顯著性差異(p＜0.01)，這表明在相同聲照強(qiáng)度和頻率下加入血卟啉可以增強(qiáng)超聲對(duì)細(xì)胞的殺傷效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示：當(dāng)聲照強(qiáng)度為1.5W/cm2，在1.1MHz、1.6MHz頻率超聲照射下，在三種溶液中(1.6MHz頻率，PRMI640溶液中除外，其A組與B組數(shù)值之間有顯著差異，但無(wú)極顯著差異，經(jīng)t檢驗(yàn)，其p＜0.05。)A組與B組數(shù)值之間無(wú)顯著差異，經(jīng)t檢驗(yàn)，其p>0.05，這表明在1.1MHz、1.6MHz，聲強(qiáng)為1.5W/cm2下加入血卟啉不能增強(qiáng)超聲對(duì)SW-480細(xì)胞的殺傷效果。表1-3和圖1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示：聲照強(qiáng)度為1.5W/cm2時(shí)，同一頻率下，針對(duì)30~120秒內(nèi)聲照時(shí)間對(duì)SW-480細(xì)胞的相對(duì)存活率無(wú)明顯影響。

　　圖1溶液照射四小時(shí)后的相對(duì)存活率

　　表1在不同溶液超聲照射12h后的相對(duì)存活率

　　表2在不同頻率超聲波照射4h后的相對(duì)存活率

　　安泰ATA-8202射頻功率放大器：

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