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細胞屬性：

方法簡介

公司實驗室分離的小鼠浦肯野采用消化法結(jié)合元專用培養(yǎng)基、化學(xué)試劑抑制法篩選制備而來，細胞總量約為5×105cells/瓶

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的小鼠浦肯野經(jīng)Neph3免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

細胞簡介：

小鼠浦肯野細胞分離自小腦皮質(zhì)組織；小腦的表面被覆著一層灰質(zhì)，叫小腦皮質(zhì)，小腦皮質(zhì)分為3層，從表及里分別為分子層、浦肯野細胞層和顆粒細胞層。皮質(zhì)里含有星狀細胞、籃狀細胞、浦肯野細胞、高爾基細胞和顆粒細胞等5種元。浦肯野細胞發(fā)出的軸突組成小腦皮質(zhì)的傳出纖維，終止于小腦白質(zhì)內(nèi)的核。浦肯野細胞（Purkinje cell）是從小腦皮質(zhì)發(fā)出的能夠傳出沖動的元。人的小腦皮質(zhì)約有1500萬個浦肯野細胞。浦肯野細胞還廣泛分布于心室。顯著的電生理特點是傳導(dǎo)性強，傳導(dǎo)速度快，可達4000mm/s。屬快反應(yīng)自律型細胞，具有舒張期自動除極化的性能，因而有自律性，但自律性強度明顯低于竇房結(jié)P細胞。這類細胞常常平行排列，細胞內(nèi)電阻低，只有心室細胞的1/3。小腦：浦肯野細胞是小腦皮質(zhì)中大的元，細胞體呈梨形，頂端發(fā)出2~3條粗大的主樹突，向外伸入分子層。主樹突沿途分支繁茂，形如展開的、扁薄的扇形，鋪展在與小腦葉片長軸垂直的平面上。樹突分支上有大量的樹突棘，與傳入纖維構(gòu)成廣泛的突觸聯(lián)系，接受傳入小腦的全部信息。軸突由細胞底部（與主樹突相對方向）發(fā)出，細長，離開胞體不遠便形成有髓纖維，向內(nèi)經(jīng)顆粒層離開皮質(zhì)進入白質(zhì)，組成小腦皮質(zhì)的傳出纖維，終止于小腦內(nèi)部的核團。一個浦肯野細胞的軸突約形成500個終末膨大，約與小腦深部核團的35個元形成突觸。心臟浦肯野細胞常常平行排列，幾個細胞互相以漿膜連接排成一個小束，小束外包繞著基底膜。細胞內(nèi)含肌原纖維很少，胞漿區(qū)內(nèi)充滿糖原顆粒、線粒體和肌漿網(wǎng)，細胞內(nèi)電阻低，只有心室細胞的1/3。浦肯野細胞內(nèi)無橫管系統(tǒng)，但膜電容比收縮細胞大，可能是由于其閏盤結(jié)構(gòu)廣泛而復(fù)雜，提供了較大的表面積的緣故。浦肯野細胞閏盤的主要成分是縫隙連接，粒著膜占的比例很少，這些可能是構(gòu)成浦肯野細胞傳導(dǎo)快的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基 含脂質(zhì)濃縮液、BSA、Monothioglycerol、Transferrin、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 元細胞樣

傳代特性 不增殖；不傳代

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

公司產(chǎn)品：

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。