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藥物研發(fā)往往需要巨額的投入，為推進一種新藥，需要花費非常長的時間。不過，隨著科學與技術(shù)的不斷發(fā)展，制藥行業(yè)已經(jīng)發(fā)生了歷史性的變革，整個醫(yī)藥工業(yè)正在大步邁入創(chuàng)新藥的時代。近些年在技術(shù)的突破之下，研發(fā)創(chuàng)新的步伐大大加快，未來行業(yè)發(fā)展的空間不斷拓寬。
圖片來源：Roche
在創(chuàng)新藥研發(fā)的快車道上，高效研發(fā)工具已成為趨勢，高通量研究為新藥研發(fā)提供了更清晰的探索。結(jié)合各種新型基因研究方法的384孔高通量電轉(zhuǎn)染平臺就是近年來加速新藥開發(fā)和疾病機理研究的其中一種高效研發(fā)工具的代表。下文分享了Lonza 384-well Nucleofector™ 在制藥*葛蘭素史克（GSK）的應(yīng)用案例，以及這款電轉(zhuǎn)儀在近期多種應(yīng)用中的文獻科研風采。
全基因組陣列CRISPR-Cas9篩選
高效了解疾病機理，加快新藥開發(fā)
GSK應(yīng)用案例
尋找新穎、經(jīng)驗證和可成藥的靶點是當前藥物發(fā)現(xiàn)的挑戰(zhàn)之一。全基因組功能喪失篩選（Genome-wide Loss-of-Function Screening）是發(fā)現(xiàn)生物過程相關(guān)基因和途徑的一種成熟而有力的方法。
基因組CRISPR篩選可用于確定參與特定疾病發(fā)生發(fā)展的途徑，以及途徑相關(guān)的特定基因，從而發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶點，開發(fā)許多候選基因。高通量篩選有望改變當前醫(yī)學領(lǐng)域的主要方式，從治療疾病癥狀轉(zhuǎn)向瞄準其基本機制。
為增強該領(lǐng)域的實力，2019年，GSK公司與加州大學的一項合作得到了業(yè)界的廣泛關(guān)注。GSK與CRISPR技術(shù)Jennifer Doudna教授，以及CRISPR篩選技術(shù)——加州大學舊金山分校的Jonathan Weissman教授創(chuàng)建了基因組研究實驗室（LGR）。旨在通過使用RNAi和CRISPR/Cas9全基因組篩選探索基因組功能，了解疾病機制，發(fā)現(xiàn)新的療法，加快新藥開發(fā)。
在SLAS2020會議與展覽上，GSK分享了“在T細胞中進行陣列CRISPR-Cas9基因編輯篩選的384孔工作流程"的研發(fā)經(jīng)驗。
圖片來源：SLAS2020
GSK使用CRISPR-Cas9在原代CD4+ T細胞中開發(fā)了一種高效的陣列基因組編輯篩選，用于確定細胞因子釋放相關(guān)的基因。在基因組編輯之前，先對T細胞進行分離、純化和擴增。隨后，利用Lonza 384-well Nucleofector™遞送由向?qū)NA（gRNA）、反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）和Cas9酶組成的RNP復合物。在靜息和激活狀態(tài)下，對編輯后的細胞進行下游的多細胞因子釋放和細胞活力檢測。
基于這一用于T細胞篩選的小型、穩(wěn)健的高通量電轉(zhuǎn)染方案和分析，GSK成功解決了原代T細胞的轉(zhuǎn)染難題，并展示了全基因組陣列CRISPR-Cas9篩選在原代細胞轉(zhuǎn)染中的潛力。
Lonza 384-well Nucleofector™電轉(zhuǎn)染平臺提供384孔板的高通量轉(zhuǎn)染，短至1分鐘的板處理時間和高重復性使其成為篩選應(yīng)用的理想工具。同時可高效轉(zhuǎn)染傳統(tǒng)方法難以轉(zhuǎn)染的原代細胞、干細胞、神經(jīng)元和細胞系，基因治療、免疫治療、細胞治療等療法的開發(fā)，為廣泛疾病領(lǐng)域帶來了新的機遇。
賦能高通量CRISPR篩選，用于疫情研究
疫情肆虐至今，已經(jīng)給全球人類健康帶來重大威脅。雖然國內(nèi)疫情局勢得以控制但卻時有反復。為破譯病毒、了解如何與病毒斗爭，傳染病的藥物開發(fā)和致病機制的研究工作一直在進行著。對于爭分奪秒的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，高效、快速的研究工具起到十分關(guān)鍵的作用。
加州大學舊金山分校的研究團隊使用Lonza 384-well Nucleofector™ 來進行陣列CRISPR篩選，以識別增強或抑制感染的宿主蛋白。
該研究通過Lonza 384-well Nucleofector™ 遞送RNP，敲除Caco-2細胞的相關(guān)基因，再對野生型和基因編輯后的Caco-2感染0.01 MOI的SARS-CoV-2。經(jīng)分析，終確定的宿主蛋白（Tom70等）代表了潛在的藥物靶點，為進一步開發(fā)新的治療方法，以及現(xiàn)有療法的重新利用（repurpose）打下了重要基礎(chǔ)。該研究于2020年12月發(fā)表于Science雜志。
在近期發(fā)表的另一項研究中，巴斯德研究所的研究團隊同樣應(yīng)用到了Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)進行高通量的CRISPR/Cas9篩選，評估了1905個ISG（IFN stimulated genes）在人肺上皮細胞中調(diào)節(jié)SARS-Cov-2復制的能力。
基于此，研究人員確定了一種限制SARS-CoV-2復制的抗病毒因子DAXX（death domain-associated protein，死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白），為疫情研究帶來了新思路。該研究于2021年5月發(fā)布在預(yù)印本bioRxiv平臺上。
助力siRNA篩選靶點，開發(fā)腦瘤候選藥物
自2020年CRISPR技術(shù)摘下諾獎桂冠以來，該領(lǐng)域的熱度不斷攀升；不過siRNA篩選仍是當前使用為廣泛的基因篩選方法。
丹麥癌癥協(xié)會研究中心的研究人員基于Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)進行了高通量siRNA文庫篩選，采用的siRNA庫包含296個基因靶點，陽性對照（INCENP9）和陰性對照(siRNA的加擾對照)，每個基因設(shè)計了3個independent siRNA。
基于此，研究人員發(fā)現(xiàn)了膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點——SPT6，并證實了SPT6丟失誘導的DNA雙鏈斷裂（DSB）是膠質(zhì)母細胞瘤特異性的。該研究于2020年9月發(fā)布在Nature Communications上。
解決原代細胞轉(zhuǎn)染難題，揭示特發(fā)性肺纖維化治療策略
除了高通量的基因篩選外，Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)對于難轉(zhuǎn)染的細胞（例如原代細胞），還有著更多優(yōu)勢。
區(qū)別于細胞系，原代細胞具有正常細胞的形態(tài)，可更真實體現(xiàn)出細胞在生物體內(nèi)的功能。然而原代細胞較難轉(zhuǎn)染，如果使用脂質(zhì)體或傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)染效率往往較低。病毒轉(zhuǎn)染也存在一些挑戰(zhàn)，比如耗時長、包裝尺寸有限、生物安全問題等。而Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)可以對不分裂的原代細胞進行高效的轉(zhuǎn)染。
阿斯利康的科學家們采用了原代細胞Lonza IPF肺成纖維細胞，探索了IPF的關(guān)鍵疾病驅(qū)動機制。研究中，Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)成功對原代健康人類肺成纖維細胞的第2代細胞進行了CRISPR-Cas9 RNP電穿孔。
研究結(jié)果證明了PPP1R15A在調(diào)節(jié)肺間充質(zhì)細胞中的主要作用，并且提示了特發(fā)性肺纖維化的一種新治療策略。該研究于2021年11月3日在scientific reports上發(fā)表。
多質(zhì)粒的高通量電穿孔，優(yōu)化CRISPR堿基編輯
CRISPR堿基編輯技術(shù)是設(shè)計細菌基因組的一種強有力的方法，不過，它的編輯制于單核苷酸替換，這是該技術(shù)的一大瓶頸。
上海交通大學長聘教軌副教授童垚俊團隊開發(fā)了一種基于CRISPR-Prime編輯技術(shù)的通用（鏈斷裂）原核生物遺傳操作工具箱，通過Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)進行高通量的多質(zhì)粒電穿孔，實現(xiàn)了大腸桿菌的質(zhì)粒和染色體的基因敲除、敲入、敲低、單堿基替換和組合編輯。該研究于2021年9月發(fā)表于Nature Communications。
Lonza 384-well Nucleofector™
技術(shù)優(yōu)勢
2021年是NucleofectorTM技術(shù)誕生20周年，這是一種被引用超過10,000次的非病毒細胞轉(zhuǎn)染方法。自開發(fā)以來的20年里，NucleofectorTM技術(shù)作為有效的非病毒細胞轉(zhuǎn)染方法推動市場，且推動了流行病學、腫瘤免疫等領(lǐng)域的研究。
Nucleofector™技術(shù)是Lonza公司的創(chuàng)新技術(shù)，是一種改進的電穿孔技術(shù)。對于轉(zhuǎn)染方法而言，兼顧轉(zhuǎn)染效率、細胞活力、維持細胞的功能性、以及處理規(guī)模和速度尤為重要。
Lonza 384-well Nucleofector™技術(shù)
具有以下顯著優(yōu)點
快速 - 在一分鐘內(nèi)處理一個384孔板，轉(zhuǎn)盤能夠處理兩個板；
高性能兼顧低材料消耗 - 高通量核轉(zhuǎn)染的細胞數(shù)量條件低至2x104個細胞；
易于使用 - 現(xiàn)有的96孔ShuttleTM方案適用；
自動化兼容 - 無縫整合到自動化液體處理環(huán)境中；
可用于陣列cDNA、RNAi或CRISPR文庫篩選
