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自體T細胞免疫療法的研究和開發(fā)進展迅速，但關鍵瓶頸在于擴大制造規(guī)模以滿足商業(yè)需求。其中一個關鍵痛點是GMP病毒載體（慢病毒和γ-逆轉錄病毒）的安全性、漫長的生產周期和高額的費用。解決這個問題的一個辦法是利用非病毒轉染方法對細胞進行基因修飾。
Lonza的4D-Nucleofector™LV 單元采用電穿孔技術，可實現自動化、可擴展多種細胞類型和應用的非病毒轉染方案。
Cocoon®平臺是實現大規(guī)模自動化生產的新工具，它可以實現細胞分離、激活、轉導、擴增、細胞清洗和收獲，同時提供整個過程中的實時生物反饋（溫度、CO2、pH和DO）。
通過將Cocoon®平臺和4D-Nucleofector™LV 單元聯合起來，可以實現非病毒基因轉導、全封閉、自動化的工作流程。
Lonza提供了一個可以降低成本、提高流程效率、提高終產品質量的聯合平臺。以下實驗的目的是證明Lonza聯合平臺的T細胞基因編輯和生產的可行性。
關鍵流程步驟：
圖1：工作流程圖
以新鮮/冷凍的PBMC作為起始，4D-Nucleofector ™轉染后，轉入Cocoon®平臺，第10天收獲終的T細胞產物。
如圖1所示，在電轉后
第0天-完成電轉的PBMC在Cocoon® cassette中靜置4小時恢復，用含有IL-2和TransAct的X-VIVO培養(yǎng)基進行80%換液。
第1天–進行50%的培養(yǎng)基交換（276ml容量）。
第3天–進行80%的培養(yǎng)基交換（450ml容量），并移除TransAct。
第4天到第9天-進行75%的培養(yǎng)基交換（450ml容量）。
第10天-收集擴增的T細胞。
在第0、1、4、7和10天取樣分析。
結果分析：
圖2 A-C：瞬時轉染的GFP表達隨著時間的推移而下降
A:%GFP+CD3+T細胞群；B:%GFP+CD4+T細胞群；C:%GFP+CD8+T細胞群。
（凍存樣品n=2 來自1個donor；新鮮樣品n=3來自2個donor）
圖3：細胞擴增曲線圖
圖4 A-B：第1天與第10天的CD4+:CD8+比率
A：第1天的CD4+:CD8+比例；B: 第10天CD4+:CD8+比例。
表1：驗收標準與終產品關鍵質量屬性
轉染效率、細胞產量、細胞活力和%CD3+細胞純度符合驗收標準。
結論：
這些研究結果說明了Cocoon®平臺聯合4D-Nucleofector™LV 單元實現非病毒細胞治療生產過程自動化的實用性。
通過在激活和擴增前轉染PBMC，此聯合平臺生產了滿足臨床相關要求（高細胞產量、轉染效率和純度）的基因修飾T細胞產物。
Cocoon®平臺和4D-Nucleofector™LV 單元提供了一種替代性的非病毒基因轉導體系。
該集成平臺提供轉染和操作可擴展性、高細胞產量、減少成本、減少操作員錯誤以及更好的過程控制，以提供高質量的細胞免疫療法。
