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新藥研發(fā)是一個長周期、高投資、高風險的過程。一款新藥在進入臨床試驗之前，非臨床階段的深入、系統(tǒng)研究至關重要。臨床前藥理藥效是其中的核心環(huán)節(jié)，藥效研究涉及藥物的基本類型、作用機制、選擇性、量效關系等方面。

體外藥效評價

抗體藥物的活性測定是對藥物的有效性和藥物效價的測定，是抗體藥物評價體系中至關重要的部分。抗體藥物的體外活性分析方法分為兩類:抗原結合能力測定和生物學活性測定。抗原結合能力測定常用的方法有ELISA法、流式細胞法等;生物學活性測定包括ADCC/ADCP/CDC檢測試驗、細胞增殖抑制、殺傷活性、凋亡以及細胞因子釋放試驗等

抗原結合能力測定

目前研發(fā)生產中主要通過測定抗體的抗原結合能力來評價活性，常用的方法有ELISA法和流式細胞儀法。

免疫測定法通常用于確定通過雜交瘤技術產生的單克隆抗體的同型。人們越來越需要高效、靈敏的檢測方法來確定這些單克隆抗體的同型。進行免疫測定常用的技術是ELISA，ELISA是一種經過時間驗證的方法，但需要多個耗時的步驟，可能導致數(shù)據的準確性受到影響。AlphaLISA是一種化學發(fā)光均質微珠技術，不需要洗滌或分離步驟，因此與ELISA相比具有顯著優(yōu)勢。

AlphaLISA檢測通常在96孔或384孔板上進行，樣品體積低至5μL，減少有價值待測樣品的消耗。總檢測時間小于3小時，是常用ELISA檢測時間的一半。在此，我們報告了使用自動化開發(fā)幾種新的AlphaLISA檢測方法來檢測雜交瘤中產生的人IgG單克隆抗體的同型。

文獻來源：Use of the JANUS Automated Workstation to Develop Efficient AlphaLISA Immunoassays for Isotyping Human Monoclonal Antibodies

生物活性測定

ADCC抗體介導細胞毒性

單克隆抗體藥物是目前藥物研發(fā)的新熱點，與小分子藥物相比，抗體類藥物具有高效、低毒、半衰期長等特點。抗體介導細胞毒性（ADCC）是引起抗體類藥物不良反應的一個關鍵限制因素。Lazar G. A. 等人在建立了以Alpha技術競爭性驗證抗體Fc片段突變體與Fc?Rs親和力檢測的體系，對計算機模擬設計出的上百種突變體，進行快速、高效的特異性檢測，以發(fā)現(xiàn)特異性更高、副作用更小的單克隆抗體藥物。

Binding of Fc variant Abs to FcγRs measured by competition AlphaScreen. Binding of alemtuzumab Fc variants to human V158 (Left) and F158 (Right) FcγRIIIa.

Alpha技術，是基于一對微珠的均相親和檢測方法，是一種非放射性、均相、可代替?zhèn)鹘y(tǒng)繁瑣ELISA技術的高效檢測方法，并可直接檢測血清、血漿或細胞裂解液等復雜生物樣品。Alpha檢測須配置高強度的激光光源，以激發(fā)出供體微珠上足量的單體氧分子。單體氧分子和受體微珠發(fā)生級聯(lián)化學反應釋放出光子。該檢測光信號為化學發(fā)光，雖背景低，但源信號強度較熒光弱，因此需要配置超靈敏PMT以達到更好的檢測效果。Revvity EnSight多模式酶標儀具有超靈敏HTS Alpha 模塊在配置激光光源和超靈敏PMT的基礎上，又對光源和PMT進行了優(yōu)化，因此其信噪比更高、檢測速度更快。

細胞活力檢測

ATP（三磷酸腺苷）是細胞活性的標志物，其僅存在于具有代謝活性的細胞內。因為細胞經歷壞死或凋亡時，ATP濃度會迅速下降，所以ATP是監(jiān)測細胞毒性、殺傷、抑制和增殖的一種很好的指示劑。

逐典細胞活力檢測試劑盒

本品為開蓋即用型試劑，只需取與待測樣品等體積的試劑加入到含細胞的測試孔中。室溫震蕩2-5分鐘使細胞裂解充分以及混合均勻，待室溫反應10分鐘后發(fā)光信號達到讀值后即可進行檢測讀值。

免疫細胞介導的特異性殺傷

在腫瘤免疫療法的開發(fā)中，無論是有效性還是安全性評價，還是進一步的抗體機制如ADCC等研究，都離不開檢測免疫細胞介導的特異性殺傷。與直接的細胞活力檢測不同，基于免疫細胞的殺傷是細胞-細胞相互作用的結果，因此，對應的檢測方法必須能夠特異區(qū)別靶細胞（腫瘤細胞）和效應細胞（免疫細胞）。針對區(qū)分的需求，目前有多種檢測方法，例如51Cr釋放法，DELFIA EuTDA細胞毒法和螢火蟲報告基因法等。

化學發(fā)光的檢測信號是酶促反應過程中釋放的光子，檢測時不需要外界激發(fā)光激發(fā)，也因此不會觸發(fā)環(huán)境中的自發(fā)背景熒光，所以化學發(fā)光檢測背景干凈、信噪比很高。但由于化學發(fā)光自身的發(fā)光特點，在同等條件下，化學發(fā)光的原始光子強度遠低于熒光強度檢測，所以化學發(fā)光需要獨立于熒光之外的超敏感檢測模式，放大檢測光子信號、減少空間串擾，才能在實驗中得到更好的檢測窗口和信噪比。

EnSight多模式酶標儀采用獨立的超敏感PMT，免光纖緊鄰樣品孔上方，顯著提高檢測靈敏度。超敏感化學發(fā)光采用優(yōu)化免光纖獨立光路，配置化學發(fā)光專用單光子暗電流超敏感PMT檢測器，檢測器前端帶有傳感器的優(yōu)化光圈，可自動探測微孔板高度，實現(xiàn)緊貼微孔板孔口檢測，減少信號損失和串擾；采用低暗電流單光子PMT，可提供50～108counts/秒的信號水平；檢測時間縮短，讀板速度更快，提高實驗效率。

CAR-T殺傷效果檢測

CAR-T細胞的殺傷活性可通過對靶細胞裂解程度來檢測。與51Cr釋放法形式類似， DELFIA EuTDA細胞毒法利用熒光放大配體BATDA特異的標記靶細胞。

BATDA加入到細胞培養(yǎng)基中，可以穿過細胞膜，被胞內酯酶裂解成TDA，TDA不能再穿過細胞膜。裂解標記的靶細胞在上清液中釋放TDA，然后轉移到實驗板上，與銪溶液結合生成熒光分子EuTDA。細胞裂解導致EuTDA的增加，因此增加的信號與標記的靶細胞死亡相關。除了靈活性和支持高通量特異性殺傷檢測外，DELFIA EuTDA細胞毒法具有TRF技術帶來的高穩(wěn)定性和重復性等優(yōu)勢，已成為主流的細胞殺傷檢測技術。

此外，TILs能夠殺傷腫瘤細胞，因此檢測TILs效率的重要指標之一檢測對腫瘤細胞的殺傷能力，Revvity公司能夠提供基于TRF技術DELFIA EuTDA檢測法。與51Cr釋放法形式類似， DELFIA EuTDA細胞毒法利用熒光放大配體BATDA特異的標記靶細胞。BATDA能迅速進入細胞，并在水解作用下形成親水的TDA留在細胞內，并在靶細胞裂解下釋放，和DELIFAEu試劑相結合形成強熒光、穩(wěn)定的螯合物EuTDA用于檢測。除了靈活性和支持高通量特異性殺傷檢測外，DELFIA EuTDA細胞毒法具有TRF技術帶來的高穩(wěn)定性和重復性等優(yōu)勢，已成為主流的細胞殺傷檢測技術。

細胞因子檢測

細胞因子是免疫反應過程中關鍵的信號轉導蛋白，通常為小于80kDa的多肽。在免疫系統(tǒng)內部和其與宿主組織細胞的交流中，細胞因子占據基礎而又重要的地位。細胞因子的種類非常多樣，并能通過旁分泌和自分泌的形式調控廣泛的免疫功能。針對常見的重要細胞因子和分泌蛋白靶點，Revvity具有HTRF，ALPHA和LANCE技術平臺，可提供支持免洗的高通量篩選解決方案。相較于傳統(tǒng)的ELISA，這些技術具有更出色的靈敏度和動態(tài)范圍，提升了抗干擾能力的同時極大簡化了操作步驟。