欧美国产日韩在线免费观看-欧美日韩成人激情一区二区-欧美久久综合一区二区-亚洲av寂寞少妇久久

在藥物研發(fā)過程中常用細胞學分析，來揭示化合物在體外誘導的效應。本文中，我們將介紹使用VICTOR Nivo進行細胞水平的HTRF檢測，分析α-微管蛋白乙?；?K40水平。在人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，常發(fā)生微管蛋白乙酰化，因而被廣泛研究。αβ-微管蛋白異二聚體形成微管，微管是細胞骨架中的基本聚合物。通過翻譯后修飾（PTMs），細胞調節(jié)微管結構和功能。α-微管蛋白在K40上的乙酰化在其他PTMs中起關鍵作用。

已知抑制HDAC6（組蛋白去乙?；?）后，會使微管蛋白乙?；险{，我們采用了小鼠成纖維細胞（NIH-3T3細胞），在VICTOR Nivo上進行了兩個HTRF實驗：首先，評估了分析所用的最佳細胞接種數(shù)量；其次，研究了化合物 Trichostatin A和Tubacin對α-微管蛋白K40乙酰化的影響。

實驗方法及結果

1細胞數(shù)量優(yōu)化

將預先收獲的NIH-3T3細胞用標準培養(yǎng)基稀釋成50,000至3,125個細胞/孔密度，100μl/孔轉移至96-孔 CulturPlate (#6005680)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。隨后，依照操作手冊，用HTRF試劑盒中自帶的細胞裂解液裂解30分鐘，取16μl/孔細胞裂解上清液，轉移至384-孔 OptiPlate(#6007290)。然后分別加入Anti-alpha-Tubulin acetyl-K40-Tb3+ Cryptate和Anti-alpha-Tubulin acetyl-K40-d2抗體各2μl，室溫孵育2小時。并設定三組對照作為質控：

陽性對照：

control lysate + Anti-alpha-Tubulin acetyl-K40-d2 + Anti alpha-Tubulin acetyl-K40-Tb3+ Cryptate

陰性對照：

lysis buffer + Anti-alpha-Tubulin acetyl- K40-d2 + Anti alpha-Tubulin acetyl-K40-Tb3+ Cryptate

空白對照：

cell lysate + detection buffer + Anti alpha- Tubulin acetyl-K40-Tb3+ Cryptate

孵育結束后，在VICTOR Nivo上檢測HTRF信號。結果顯示，陽性對照（control lysate）與陰性對照窗口大于2，符合實驗指南；與陰性對照比值大于4。測試了５個NIH-3T3細胞接種密度，HTRF比值呈現(xiàn)密度依賴關系，選擇接種密度12,500個細胞/孔用于后續(xù)實驗。

2化合物檢測

據(jù)報道，化合物Trichostatin A和Tubacin抑制HDAC6，從而增加細胞微管蛋白乙酰化。在96孔板中，接種NIH-3T3細胞12,500個/孔，培養(yǎng)1天后，加入待測化合物50 μl/孔。用另一96孔板制備化合物，以培養(yǎng)基稀釋12個化合物濃度（DMSO終濃度為0.5%）。Trichostatin A檢測濃度范圍為1.4x10-11–2.5x10-6M，Tubacin濃度范圍為1.4x10-9–2.5x10-4M。同時設置DMSO對照和未處理細胞對照。給藥18小時后，同上述方法檢測。兩種化合物均呈現(xiàn)劑量-效應關系，EC50 (Trichostatin A)=40.5±0.2nM 及EC50 (Tubacin)=4.95±0.84uM，與文獻報道所述數(shù)量級相符。

總結

VICTOR Nivo是一款體積小、功能強大的桌面多功能酶標儀，配備了所有主要檢測技術：光吸收、化學發(fā)光、熒光強度、熒光偏振、AlphaScreen和時間分辨熒光（包括HTRF、LANCE和DELFIA）。通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)基于細胞的α-微管蛋白乙酰-K40 HTRF分析試劑盒易于操作，非常適合在VICTOR Nivo上進行HTRF模式檢測。在一系列實驗中，VICTOR Nivo操作簡單智能，用戶可按照protocol推薦的檢測參數(shù)，無需進一步調整，即可讀板。總之，HTRF認證的VICTOR Nivo適用并支持HTRF試劑盒檢測應用。

參考文獻

Using the VICTOR Nivo for Cell-Based HTRF Assays | PerkinElmer