欧美国产日韩在线免费观看-欧美日韩成人激情一区二区-欧美久久综合一区二区-亚洲av寂寞少妇久久

隨著科研水平的日益發(fā)展，對(duì)于疾病及相關(guān)治療的研究已越來(lái)越多的由體外分子及 細(xì)胞水平轉(zhuǎn)移到活體動(dòng)物水平層面，而傳統(tǒng)的儀器和方法很大程度限制了研究人員在活 體動(dòng)物水平直接監(jiān)測(cè)疾病的整體發(fā)展過(guò)程以及新藥的臨床前研發(fā)。因此，構(gòu)建基于活體 動(dòng)物水平的新型研究平臺(tái)是開展疾病研究及藥物研發(fā)的重要基礎(chǔ)。小動(dòng)物活體光學(xué)成像 系統(tǒng)是將分子及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)從體外研究水平發(fā)展到活體動(dòng)物研究水平的前沿性臨 床前分子影像技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)采用生物發(fā)光與熒光探針標(biāo)記研究對(duì)象，借助靈敏的光 學(xué)檢測(cè)儀器，直接在活體動(dòng)物水平監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展變化并開展相關(guān)藥物的臨床前研發(fā)。 由于光學(xué)成像因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單、靈敏度高、不涉及到放射性等優(yōu)勢(shì)， 已被越來(lái)越廣泛地 應(yīng)用于臨床前疾病研究的各個(gè)領(lǐng)域，包括癌癥研究、器官損傷研究、心血管疾病研究、 神經(jīng)疾病研究、炎癥疾病研究、免疫學(xué)及干細(xì)胞研究等。在新藥的臨床前研發(fā)階段，全 球藥企都已將小動(dòng)物活體光學(xué)成像技術(shù)應(yīng)用于藥效和安全性評(píng)價(jià)研究、藥物的靶向 及生物分布研究、新型藥物載體的研發(fā)等新藥臨床前研究的多個(gè)方面。光學(xué)成像因?yàn)椴?作簡(jiǎn)單、靈敏度高、不涉及到放射性等優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用非常廣泛，包括生命科學(xué)、藥學(xué)和材 料學(xué)等眾多領(lǐng)域。同樣小動(dòng)物活體光學(xué)成像技術(shù)在肝損傷領(lǐng)域也發(fā)揮著重要的作用。四 氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)是一種強(qiáng)烈的能夠引起肝細(xì)胞壞死的化合物，一直被研 究者用來(lái)誘發(fā)各種肝損傷模型以闡明化合物肝毒性機(jī)制或肝損傷保護(hù)機(jī)制。CCl4會(huì)引 起氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而引起自由基變化、引發(fā)與環(huán)氧化酶（COX）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān) 反應(yīng)，CCl4自身的溶酶作用可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷等，通過(guò)小動(dòng)物活體光學(xué)成像技術(shù)即可 在活體狀態(tài)下檢測(cè)肝臟損傷時(shí)細(xì)胞和分子水平的這些生物過(guò)程，并可對(duì)治療肝損傷的藥 物和干細(xì)胞等的治療效果和分布、靶向等進(jìn)行評(píng)價(jià)。以下是詳細(xì)的闡述。

一.利用熒光指示探針檢測(cè)肝臟的氧化損傷

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基 （reactive oxygenspecies,ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species,RNS）產(chǎn)生過(guò) 多，氧化程度超過(guò)氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。大 量的研究顯示，氧化應(yīng)激參與了多種肝臟疾病的形成發(fā)展過(guò)程，例如酒精性和非酒精性 脂肪肝、病毒性肝炎、肝纖維化、肝癌、缺血再灌注的損傷。斯坦福大學(xué)Shuhendler教 授在2014年發(fā)表一篇文章，在文章中就設(shè)計(jì)并研發(fā)了一種肝臟氧化損傷的指示劑。其原 理正是基于肝損傷的兩個(gè)關(guān)鍵生物標(biāo)志物——ROS和RNS，二者的產(chǎn)生機(jī)制不同，因此 對(duì)兩者同時(shí)檢測(cè)可廣泛的檢測(cè)疾病、化合物、藥物等對(duì)肝臟造成的氧化損傷及對(duì)不同治 療方法的效果做出評(píng)價(jià)。此指示劑是一種半導(dǎo)體聚合物納米粒（semiconducting polymer nanoparticle,SPN），包含三個(gè)核心元件：（1）靶向元件：通過(guò)聚乙二醇聯(lián)連接半乳糖 殘基，可以與肝細(xì)胞表面的半乳糖受體結(jié)合，是一種常見的肝靶向方法；（2）活性氧 感應(yīng)元件：化學(xué)發(fā)光劑雙草酸酯（CPPO）在活性氧存在的條件下，迅速分解產(chǎn)生高能 中間體1,2-二氧雜環(huán)丁烷二酮，激發(fā)附近染料分子發(fā)光，檢測(cè)發(fā)出的光子強(qiáng)度即可評(píng)活性氧的程度；（3）活性氮感應(yīng)元件：青色素染料IR775S發(fā)射680nm、820nm兩種熒光， 因熒光能量偏振轉(zhuǎn)移（FRET），發(fā)射的680nm的光子作為激發(fā)光激發(fā)染料分子發(fā)射出 820nm的光，而680nm光子減弱甚至消失；而在活性氮存在的條件下，F(xiàn)RET現(xiàn)象消失 680nm熒光信號(hào)增強(qiáng)，檢測(cè)此信號(hào)的強(qiáng)度即可評(píng)價(jià)活性氮的強(qiáng)度。

二.利用水動(dòng)力學(xué)模型檢測(cè)肝臟損傷

水流動(dòng)力學(xué)注射（hydrodynamic-based procedure）是一種高效的基因轉(zhuǎn)移方式，即 將約小鼠體重8-10%的質(zhì)粒DNA溶液在短時(shí)間內(nèi)快速注射到小鼠體內(nèi)，這種方法能讓 表達(dá)載體穩(wěn)定存留在肝臟一段時(shí)間并進(jìn)行表達(dá)。水動(dòng)力注射是非常成熟的方法，軍事醫(yī) 學(xué)科學(xué)院詹林盛研究員就利用水動(dòng)力學(xué)模型開展了一系列圍繞肝臟疾病的研究，例如丙 型肝炎、肝臟毒物代謝等，已經(jīng)成功建立了多種小鼠肝臟熒光素酶調(diào)控模型。例如詹林 盛研究員在2013年建立了在活體水平檢測(cè)肝臟NF-κB表達(dá)的模型小鼠。NF-κB信號(hào)通 路在維持機(jī)體正常的生理功能中起到很重要的作用。經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路與基體的 自身免疫有關(guān)，而炎癥反應(yīng)是自身免疫反應(yīng)的重要表現(xiàn)形式，因此NF-κB的表達(dá)可以 代表炎癥的發(fā)生和發(fā)展。同樣在CCl4誘導(dǎo)產(chǎn)生急性肝損傷中，NF-κB信號(hào)通路會(huì)被激 活。在實(shí)驗(yàn)中將pattB-NF-κB-Fluc 報(bào)告載體和φC31o整合酶載體通過(guò)水動(dòng)力學(xué)方式注射 到小鼠體內(nèi)，在整合酶的作用下pattB-NF-κB-Fluc會(huì)重組到肝細(xì)胞的染色體中，這樣就 可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)NF-κB在肝臟的激活表達(dá)情況，從而達(dá)到判斷肝臟的損傷程度及藥物治 療效果的目的。

細(xì)胞凋亡是CCl4造成肝損傷的另一個(gè)機(jī)制，而caspase-3被認(rèn)為是最終的凋亡執(zhí)行分 子，詹林盛研究員同樣用水動(dòng)力學(xué)注射方法建立了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肝臟細(xì)胞凋亡的模型小鼠， 該模型是attB-ANLuc(DEVD)BCLuc和φC31o整合酶載體采用水動(dòng)力學(xué)方式注射到小鼠 體內(nèi)，同樣在整合酶的作用下，attB-ANLuc(DEVD)BCLuc會(huì)重組到肝臟細(xì)胞的染色體 中穩(wěn)定表達(dá)。ANLuc(DEVD)BCLuc是將熒光素酶基因的N端和C端分別連上能夠相互作 用的蛋白A、B的基因，兩者之間以caspase-3識(shí)別位點(diǎn)相連，當(dāng)肝臟未發(fā)生凋亡時(shí)caspase-3 不表達(dá)，熒光素酶的N端和C端由于空間位置受阻無(wú)法形成完整的熒光素酶結(jié)構(gòu)，不能 催化底物反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)，而一旦凋亡發(fā)生caspase-3隨即表達(dá)就會(huì)將熒光素酶的N端 和C端之間的肽段去除，在A、B蛋白的相互作用下，就會(huì)形成完整的熒光素酶結(jié)構(gòu)，能 夠與底物反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)。利用該小鼠模型即可實(shí)時(shí)檢測(cè)caspase-3的表達(dá)，從而評(píng)價(jià) 肝臟細(xì)胞的凋亡。

三.利用轉(zhuǎn)基因小鼠檢測(cè)肝損傷

CRISPR/Cas9等轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，使得建立轉(zhuǎn)基因小鼠的成本大大降低，同時(shí)也 縮短了轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建的周期，因此更利于利用轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠的模型來(lái)對(duì)疾病發(fā)生 機(jī)制及治療效果等進(jìn)行研究。將熒光素酶的報(bào)告基因插入與肝臟損傷相關(guān)的基因的啟動(dòng) 子下建立轉(zhuǎn)基因小鼠，即可在活體狀態(tài)下，利用光學(xué)成像的方式對(duì)肝臟損傷進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng) 態(tài)的檢測(cè)。

血紅素氧化酶（Heme oxygenase，HO）是一種催化血紅素的起始酶和限速酶，有 著重要的生物作用。HO在體內(nèi)主要有三種同工酶形式，即HO-1、HO-2和HO-3。這 三中酶是不同基因的表達(dá)產(chǎn)物，但均能作用于血紅素將其分解產(chǎn)生相同摩爾數(shù)的生物活 性分子：一氧化碳、膽紅素和鐵離子。其中HO-1又稱為熱休克蛋白32是生物體內(nèi)最 容易被誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗氧化酶，HO-1在多數(shù)組織中不表達(dá)或低表達(dá)，但低氧、激素、氧 化劑等因素均能誘導(dǎo)其表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能而發(fā)揮抗感染、抗氧化、抗細(xì)胞增 殖等作用，在眾多疾病中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠或大鼠經(jīng)腹腔注射 CCl4 建立急性肝損傷模型后，在注射CCL4 3小時(shí)后HO-1開始表達(dá)，12h時(shí)到達(dá)峰值， 而正常肝臟組織中未見HO-1表達(dá)，因此HO-1的表達(dá)水平可以作為肝損傷的一個(gè)指標(biāo)， 從而來(lái)鑒定肝臟損傷程度及藥物的治療效果。將熒光素酶的基因插入小鼠HO-1基因啟 動(dòng)子下游建立HO-1-Luc轉(zhuǎn)基因小鼠，即可應(yīng)用生物發(fā)光的成像模式實(shí)時(shí)檢測(cè)HO-1基 因的表達(dá)。

上圖左.HO-1-luc模型小鼠在尾靜脈或者腹腔注射CdCl2（10 μM）后HO-1表達(dá)隨時(shí)間的變化， A左.尾靜脈 注射CdCl2或PBS后進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)，并且當(dāng)CdCl2組HO-1表達(dá)接近對(duì)照組時(shí)，重新注射CdCl2，A右.尾靜脈 與腹腔注射CdCl2進(jìn)行比較；B、C分別為尾靜脈或腹腔注射CdCl2后進(jìn)行生物發(fā)光成像的圖像。右.不同劑量 CdCl2在尾靜脈注射9小時(shí)后，模型小鼠正面和背面的生物發(fā)光圖像，從上到下劑量分別為(control,5, 10, and 20 μmol/kg).Weisheng Zhang.et al.J Mol Med (2002) 80:655–664

血清淀粉樣蛋白A(Serum amyloid A,SAA)是一種急性期反應(yīng)蛋白，血中濃度主要由 合成速度決定，而肝功能正常時(shí)其合成主要決定于細(xì)胞因子的水平。當(dāng)組織發(fā)生感染、 炎癥或者損傷時(shí)，SAA可以誘導(dǎo)產(chǎn)生組織損傷修復(fù)過(guò)程所需的酶，吸引免疫細(xì)胞到達(dá)炎 癥部位加強(qiáng)免疫反應(yīng)作用。若外源的藥物或化合物會(huì)引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生損傷或炎癥時(shí)，SAA 的表達(dá)會(huì)迅速上升，因此SAA也可以作為肝臟損傷的一個(gè)標(biāo)志物。同樣我們建SAA-Luc 轉(zhuǎn)基因小鼠同樣實(shí)時(shí)檢測(cè)SAA的表達(dá)，從而肝臟的損傷程度。

上述例子中提到CCl4誘導(dǎo)產(chǎn)生急性肝損傷中，NF-κB信號(hào)通路會(huì)被激活，因此我 們可以構(gòu)建NF-κB-Luc轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)生物發(fā)光成像模式即可實(shí)時(shí)檢測(cè) NF-κB的表 達(dá)，同樣也可以達(dá)到判斷肝臟的損傷程度及藥物治療效果的目的。例如下圖就利用 NF-κB-Luc 轉(zhuǎn)基因小鼠模型評(píng)價(jià)了牛樟芝對(duì)肝臟損傷的預(yù)防作用。從下圖可以看出，LPS 注射后，腹腔出現(xiàn)很強(qiáng)的生物發(fā)光信號(hào)，其信號(hào)主要來(lái)源于肝臟，而經(jīng)牛樟芝預(yù)防組則 信號(hào)明顯弱于LPS誘導(dǎo)組，從而說(shuō)明牛樟芝對(duì)LPS引起的肝臟的炎癥損傷有一定的預(yù) 防效果。

（A）應(yīng)用LPS（脂多糖），LPS+A. camphorate（脂多 糖和牛樟菇），Mock（陰性對(duì)照）經(jīng)腹腔注射后，小 鼠生物發(fā)光和定量結(jié)果。(B) 體外Spleen（胰臟）Liver （肝臟）Kidney（腎臟），Mesenteric lymph nodes (腸 系膜淋巴結(jié))，Small intestine (小腸) 的生物發(fā)光成像。 Hseu et al, Food and Chemical Toxicity,

四.利用光學(xué)探針檢測(cè)肝臟的炎癥反應(yīng)

CCl4 腹腔注射后炎癥相關(guān)的金屬蛋白酶（MMP）-2和-9的表達(dá)增高，因此應(yīng)用特 異性MMP敏感的熒光探針同樣可以監(jiān)測(cè)肝臟炎癥發(fā)生發(fā)展及評(píng)價(jià)藥物的治療或預(yù)防效 果。該探針的原理是兩個(gè)熒光基團(tuán)通過(guò)MMP的底物肽段連接，此時(shí)由于二者接近，熒 光基團(tuán)相互抑制，不能產(chǎn)生熒光信號(hào)，而當(dāng)探針進(jìn)入MMP高表達(dá)的炎癥位點(diǎn)時(shí)，MMP 就會(huì)水解熒光基團(tuán)之間的肽段，兩個(gè)熒光基團(tuán)分開產(chǎn)生熒光。而目前市場(chǎng)已有商品化的 熒光探針對(duì)MMP表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)熒光信號(hào)的強(qiáng)度可以反應(yīng)炎癥嚴(yán)重程度。

五．檢測(cè)治療性藥物或干細(xì)胞在肝臟的分布

愈來(lái)愈多的證據(jù)表明，在適當(dāng)?shù)拇碳は?，MSCs在體外可以分化為正常的肝細(xì)胞， 因此間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植在治療肝損傷中有著很好的前 景。利用小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)，對(duì)MSCs在急性肝損傷小鼠體內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)示蹤，了 解MSCs在小鼠體內(nèi)遷移、分布和定植情況，從而在臨床前動(dòng)物水平評(píng)價(jià)MSCs移植治療 肝損傷的可行性，并對(duì)注射劑量、注射次數(shù)、注射方式等變量進(jìn)行研究。例如中山大學(xué) 第三附屬醫(yī)院的研究人員就將熒光素酶標(biāo)記的MSCs通過(guò)不同的方式移植入肝損傷受體 小鼠的體內(nèi)，通過(guò)生物發(fā)光成像的方式檢測(cè)了MSCs在模型小鼠內(nèi)的分布情況，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)不同的移植方式MSCs的分布不同，經(jīng)下腔靜脈注射主要分布在小鼠肺部、經(jīng)腸系膜 上靜脈和心內(nèi)注射的方式主要分布在肝臟。

同樣采用熒光染料對(duì)治療肝損傷的藥物或藥劑進(jìn)行標(biāo)記后，即可通過(guò)熒光成像的方 式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藥物對(duì)肝臟的靶向性及在動(dòng)物體內(nèi)的分布代謝情況。例如，Sun-Jung Kim 就設(shè)計(jì)了一種靶向肝臟的siRNA載體復(fù)合物，該復(fù)合物由以聚乙酰亞胺（PEI）為骨架， N-氨基葡糖胺(GlcNAc)為靶頭（特異性靶向肝纖維化位點(diǎn)），ICG作為熒光指示劑，該 載體可攜帶siRNA用于肝纖維化的成像和治療，在文章中Sun-Jung Kim利用小動(dòng)物活體 光學(xué)成像技術(shù)評(píng)價(jià)了該載體對(duì)肝臟的靶向效果和實(shí)時(shí)分布。

綜上所述，小動(dòng)物活體光學(xué)成像技術(shù)可以在活體狀態(tài)下，在細(xì)胞和分子水平實(shí)時(shí)動(dòng) 態(tài)的監(jiān)測(cè)肝損傷發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過(guò)程，并對(duì)藥物或干細(xì)胞等的治療效果、分布、靶向 等做出準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)，是肝損傷研究領(lǐng)域的重要工具。