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SCIEX 液質聯用技術測定果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇的應用
閱讀：3589 發(fā)布時間：2020-12-9引言：傳統(tǒng)檢測單糖、雙糖的分析方法有化學法、光譜法、GCMS、HPLC等方法。其中化學法無法準確測定單種糖的含量；光譜法的工作繁瑣、誤差比較大；GC-MS方法需要進行衍生化反應，前處理復雜，不利于快速分析；HPLC法雖然相比其他方法靈敏度好、檢測速度快、適用范圍廣，但也存在檢出限較低、抗干擾能力差，尤其對于食品中低濃度的單糖、雙糖很難進行測定，無法滿足現階段對食品檢測快速、靈敏、準確的要求。LCMS/MS技術通過質譜的高選擇性和高靈敏度能夠降低目標物的檢出限、提高檢測的重現性。由于糖類為水溶性化合物，在常規(guī)的C18色譜柱上沒有保留，而采用其他填料的親水色譜柱也很難得到太好的峰形或分離度。因此，選取一款合適的分析糖的色譜柱是液質分析糖的實驗關鍵點。目前專門測試糖的糖柱通常為液相柱，需要用到100%純水相來作為流動相，并且流速通常高于1 mL/min，這樣的色譜條件對于大多數的質譜離子源來說都無法實現化合物的有效離子化，或者只有通過分流才能實現，但是分流后將損失儀器的檢測靈敏度，失去了使用液質聯用儀測試糖的提高靈敏度的目的。 SCIEX 的LC-MS/MS液質聯用系統(tǒng)的一大特點就是強大的 TurboV™離子源技術，離子源的加熱能夠達到750℃，ESI源耐受流速范圍 5 µL/min～3.0 mL/min，APCI源耐受流速范圍50 µL/ min～3.0 mL/ min，因此可以直接使用HPLC糖柱在SCIEX液質聯用儀上進行測試，即實現了好的分離效果，又提高了檢測靈敏度。本實驗使用SCIEX Triple Quad™ 4500 質譜系統(tǒng)同時測定梨中的葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇四種糖, 實驗方法簡單、靈敏度高、選擇性好。
實驗思路 1. 配制果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇標準曲線，測試四種水溶性糖的低檢出限； 2. 測試碭山酥梨果實中四種水溶性糖的含量，了解梨中四種糖的比例關系。
樣品處理 1．移取果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇標準品，用純水稀釋，配制成 50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 µg/mL、5 µg/mL 和 10 µg/mL 的標準溶液。 2．梨果實中可溶性糖的提取。
梨果實中糖的提取材料：碭山酥梨（采集于南京農業(yè)大學江浦園藝實驗站）將樣品去皮削成小塊，液氮速凍后儲存于-80冰箱。稱取2g樣品，加液氮研磨后，加入80%乙醇7 mL混勻。在37℃水浴中恒溫 30 min，超聲提取15 min，10000 r/min離心15 min。將上清液移入25 mL容量瓶。重復提取3次，后加入80%乙醇定容至25 mL。取2 mL溶液旋轉蒸發(fā)，用1 mL水溶解蒸干后的固體，溶解時用超聲波處理，盡量溶解*。溶液離心后，用0.22 µm水系濾膜處理，即可用于測定。實驗過程中發(fā)現此前處理過程提取出的糖樣品在液質儀器上的響應信號過高，終樣品又用純水稀釋10倍和1000倍分別上機測試。
色譜方法色譜柱：Hi-Plex Ca, 300×7.7 mm；流動相：100%純水洗脫流速：1 mL/min； 柱溫：85℃；進樣量：10 µL
質譜方法 SCIEX Triple Quad™ 4500 質譜系統(tǒng) 掃描方式：MRM采集方式離子源：APCI Negative 離子源參數 CUR：氣簾氣 25.00 psi NC：離子化電流 -2.00 uA TEM：加熱溫度 400.00 ℃ GS1：噴霧氣 75psi CAD：碰撞氣 Medium
掃描方式：MRM采集方式離子源：APCI Negative 離子源參數 CUR：氣簾氣 25.00 psi NC：離子化電流 -2.00 uA TEM：加熱溫度 400.00 ℃ GS1：噴霧氣 75psi CAD：碰撞氣 Medium
結果與討論 ：1、色譜條件的選擇本實驗選擇使用液相糖分析柱Hi-Plex Ca, 300×7.7 mm， 1 mL/min 純水流動相，對果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇四種糖進行分離，其中果糖和葡萄糖為同分異構體，用該色譜柱可以得到很好的分離，每種化合物的峰形都很對稱，峰形較
3、樣品提取條件的優(yōu)化本實驗中樣品提取過程基于以前使用液相檢測時的靈敏度而開發(fā)，因此在用80%乙醇水對樣品提取之后，通過旋轉蒸發(fā)再用純水復溶的過程將80%乙醇水溶劑替換成純水。而采用液質聯用技術方法檢測靈敏度比液相提高1000倍以上，樣品濃度無需過高，因此在原有的提取步驟之后，只需用純水將樣品稀釋10倍以上，過濾膜即可上機測試。既可以降低樣品的基質效應，又大大縮短了樣品前處理所需時間。
……
總結：本實驗通過SCIEX LC-MS/MS技術同時檢測了果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇四種可溶性糖，實驗中測試了不同的色譜柱對靈敏度的影響，終選擇了HPLC糖柱來分析。利用了SCIEX Turbo V™ 離子源強大的耐高流速的特點，在SCIEX Triple Quad™ 4500系統(tǒng)上直接使用了HPLC色譜條件，100%純水1mL/min流速下做液質分析，依然得到了良好的檢測靈敏度。方法的定量限≤50ng/mL。以碭山酥梨為樣品進行了可溶性糖的提取前處理，用該液質方法進行糖含量檢測，檢測結果顯示經過不同時間的栽培處理梨中糖分含量差異很大，以含糖量高時的梨樣品為例，推算出此時1個梨果實中約含果糖12g、葡萄糖7g、蔗糖7g、山梨醇32g。 SCIEX LC-MS/MS系統(tǒng)具有穩(wěn)定耐用易維護，靈敏度高和重現性好等特點，Turbo V™離子源技術使質譜檢測耐受不同的液相流速，方法建立和開發(fā)更加簡便，即使是HPLC的高流速純水方法依然能夠得到很好的檢測效果。